中國北方沿海潮間帶常見鏡蛤的種類

劉澤浩, 李 捷, 楊學玲, 王海艷, 李永強, 張素萍, 徐鳳山

（1. 青島理工大學, 山東 青島 266033; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 天津市寶坻區(qū)畜牧水產局, 天津 寶坻 301800）

中國北方沿海潮間帶常見鏡蛤的種類

劉澤浩1, 李 捷1, 楊學玲3, 王海艷2, 李永強1, 張素萍2, 徐鳳山2

（1. 青島理工大學, 山東 青島 266033; 2. 中國科學院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 天津市寶坻區(qū)畜牧水產局, 天津 寶坻 301800）

在形態(tài)學和分子生物學（28S rRNA、COI部分序列）分析的基礎上, 對我國北方典型海區(qū)遼寧丹東, 山東煙臺、威海, 江蘇連云港的常見鏡蛤進行了取樣和分類地位的研究。結果表明: 日本鏡蛤（Dosinia japonica）、薄片鏡蛤（Dosinia corrugata）和餅干鏡蛤（Dosinia biscocta）為我國北方沿海潮間帶常見且大量分布的種類, 其中餅干鏡蛤與日本鏡蛤的遺傳距離比較接近（以較高支持率聚為一支）。連云港的餅干鏡蛤以及丹東的薄片鏡蛤的不同個體間存在差異, 對這兩地區(qū)的樣品還有待作進一步的研究。

鏡蛤（Dosinia）; 分類; COI; 28S rRNA

鏡蛤屬于軟體動物門, 雙殼綱, 簾蛤目, 簾蛤科,鏡蛤亞科, 鏡蛤屬[1], 棲息于潮間帶至潮下帶淺海, 在中國南、北沿海均有分布, 可食用, 具有一定的經濟價值。文獻記載中國北方常見鏡蛤有日本鏡蛤（Dosinia japonica）、薄片鏡蛤（Dosinia corrugata）、餅干鏡蛤（Dosinia biscocta）、高鏡蛤（Dosinia altior）、凸鏡蛤（Dosinia derupta）[1～4]。由于鏡蛤外殼形態(tài)相近, 通常以外套竇和小月面的形狀為其主要分類特征, 種類鑒定困難。同物異名和異物同名現(xiàn)象比較嚴重。專家對于中國北方沿海鏡蛤種類的報道有所不同: 莊啟謙[2]和齊鐘彥等[3]報道中國北方沿海的鏡蛤種類有: 凸鏡蛤（D. derupta）、日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D.corrugata）、餅干鏡蛤（D. biscocta）、高鏡蛤（D. altior）;徐鳳山、張素萍記述中國北方海域的鏡蛤種類有: 日本鏡蛤（D. japonica）、餅干鏡蛤（D. biscocta）、高鏡蛤（D.altior）、薄片鏡蛤（D. corrugata）[1]。

本研究對遼寧丹東, 山東煙臺、威海, 江蘇連云港 4個海區(qū)潮間帶的鏡蛤進行取樣, 并對其形態(tài)特征和28S rRNA、線粒體COI部分序列進行分析, 認為目前中國北方沿海潮間帶近海海域主要鏡蛤種類有日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）和餅干鏡蛤（D. biscocta）。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

研究用的鏡蛤分別采自中國遼寧省的丹東、山東省的煙臺和威海、江蘇省的連云港 4個海區(qū)的潮間帶（表 1, 圖 1）。形態(tài)上初步鑒定為日本鏡蛤（D.japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）、餅干鏡蛤（D.biscocta）。樣品采集后活體運回, 立即解剖, 取出閉殼肌、足、外套膜, 保存于96%的酒精中, 以備實驗用。

1.2 實驗方法

1.2.1 基因組DNA提取

取30 mg保存于96%酒精中的樣品閉殼肌組織,基因組 DNA的提取采用 TIANGEN海洋動物組織DNA提取試劑盒。獲得的DNA樣品用0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測, 并將一部分模板稀釋到 100 mg/L留作實驗用, 其余未稀釋的模板母液放于－20°C冰箱中備用[6～12]。

1.2.2 PCR擴增和測序

擴增反應在BIO-RAD公司生產的MyCyclerTM擴增儀上進行。用于28S rRNA片段擴增的引物為:28SD1F（5′-GGGACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3′）和 28SD6R（5′-CCAGCTATCCTGAGGGAAACTTCG-3′）[13]; 用于COI基因片段擴增的引物為: COIL1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′）和 COIH-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′）[14]。50 μL 的 PCR 擴增體系為: 1.5mmol/L MgCl2;200 μmol/L dNTP; 0.2 μmol/L 引物; 100 ng 模板DNA; 2U Taq 酶; 5 μL 的 10×buffer[5]。擴增反應條件如下: 94°C 預變性 4 min; 94°C 變性 40 s,60°C（28S rRNA）/48°C（COI）退火 40 s, 72°C 延伸 1 min 15 s, 共 30 個循環(huán); 最后 72°C 延伸 10 min[8～12]。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。PCR產物由北京三博遠志生物技術有限公司進行純化回收、測序。

表1 取樣地點、環(huán)境及測序樣品數(shù)Tab. 1 Locations, habitats numbers of samples

圖1 鏡蛤取樣地點的全國分布圖Fig. 1 A map of China’s coast showing collecting sites ofDosiniaand related sites in our paper

1.2.3 序列分析

用BioEdit軟件并結合DNA正反向序列圖譜對DNA序列進行校正。用 Philip3.5軟件用鄰接法（neighbor-joining method, NJ）和最大簡約法（maximal parsimony method, MP）建立系統(tǒng)發(fā)生樹[5～12]。系統(tǒng)樹做Bootstrap檢驗[5]。

2 實驗結果

2.1 不同海區(qū)潮間帶鏡蛤形態(tài)分析

對采自不同海區(qū)的鏡蛤進行形態(tài)分析, 發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)鏡蛤的形態(tài)有所差異。連云港贛榆地區(qū)鏡蛤的外套竇有所差異, 有的個體外套竇窄且先端尖,有的個體外套竇寬且先端鈍圓（圖 2b）。威海與海陽地區(qū)鏡蛤的形態(tài)差異較小。在本研究中丹東地區(qū)鏡蛤的鉸合齒、小月面存在形態(tài)差異（圖2c, 圖6）。

圖2 不同海區(qū)潮間帶鏡蛤的形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics ofDosiniasfrom different intertidal areas

2.2 不同海區(qū)潮間帶鏡蛤的分子系統(tǒng)學分析

對鏡蛤進行28S rRNA、COI序列測定, 測得單倍型用D. corrugate（DDC）、D. japonica（WH/HY）、D. corrugate（DDA）、D. corrugate（DDB）、D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）表示。

對本研究測得的每個單倍型和 Genbank中已登載的日本鏡蛤（D. japonica,DQ343851）、青蛤（Cyclina sinensis,DQ343849）序列進行聚類分析,青蛤（C.sinensis,DQ343849）作為外群。所測得序列用Philip3.5軟件分析, 用最大簡約法（MP）和相鄰法（NJ）進行聚類分析得到的 MP樹和 NJ樹表明（圖3和圖4）: 海陽地區(qū)（D. japonica（HY））、威海地區(qū)（D. japonica（WH））的鏡蛤和 Genbank中登載的（D. japonica,DQ343851）聚為一支; 威海地區(qū)（D. corrugata（WH））、丹東地區(qū)（D. corrugata（DD））和贛榆地區(qū)（D. corrugata（GY））的鏡蛤聚為一支。贛榆地區(qū)（D.biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB））鏡蛤聚為一支。

圖3 根據(jù)28S rRNA部分序列數(shù)據(jù)構建的NJ樹（A）和MP樹（B）Fig. 3 Phylogenetic trees based on neighbour-joining（A）and maximal parsimony（B） analysis of partial 28S rRNA sequence using Kimura two-parameter distances with 1000 bootstrap

威海、丹東、贛榆地區(qū)鏡蛤D. corrugate（WH/DD/GY）之間的遺傳距離為 0～0.1%。威海、海陽地區(qū)鏡蛤D. japonica（WH/HY）之間遺傳距離為 0, 與Genbank登載的D. japonica（DQ343851）遺傳距離為0.1%。贛榆地區(qū)鏡蛤D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為 0.1%。D. japonica（WH/HY）與D. corrugata（WH/DD/GY）之間的遺傳距離為 1.17%～1.27%,D. japonica（WH/HY）與D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為0.39%～0.49%,D. corrugata（WH/DD/GY）與D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為1.57%～1.79%（表2）。

D. corrugata（WH/DD/GY）之間的遺傳距離為0～1.01%,D. biscocta（GY）之間的遺傳距離為 0.17%,D. japonica（WH）、D. japonica（HY）之間的遺傳距離為 0～0.17%。D. corrugata（WH/DD/GY）與D. biscocta（GY）的遺傳距離為 16.78%～17.53%,D. corrugata（WH/DD/GY）與D. japonica（WH/HY）的遺傳距離為 16.09%～16.94%,D. biscocta（GY）與D. japonica（WH/HY）的遺傳距離為 12.00%～12.41%[5]（表3）。

圖4 利用COI部分序列數(shù)據(jù)構建的NJ樹（A）和MP樹（B）Fig. 4 Phylogenetic trees based on neighbour-joining （A）and maximal parsimony （B） analysis of partial mtCOI sequences using Kimura two-parameter distances with 1000 bootstrap

3 討論

3.1 中國北方沿海潮間帶常見鏡蛤的種類

文獻記載中國北方沿海潮間帶常見鏡蛤有日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）、餅干鏡蛤（D. biscocta）、高鏡蛤（D. altior）[1～3]。凸鏡蛤主要分布在中國各海區(qū)的近岸淺水區(qū)[1], 本研究未涉及凸鏡蛤（D. derupta）的分類。本研究對遼寧丹東、山東煙臺、威海、江蘇連云港 4個海區(qū)潮間帶常見鏡蛤的形態(tài)和28S rRNA、線粒體COI部分序列進行分析, 認為中國北方沿海潮間帶主要鏡蛤種類有日本鏡蛤（D. japonica）、薄片鏡蛤（D. corrugata）、餅干鏡蛤（D. biscocta）。分子系統(tǒng)樹表明, 威海、海陽地區(qū)鏡蛤D. japonica（WH）、D. japonica（HY）與 Genbank中登載的Dosinia japonica聚為一支, 遺傳距離比較小, 為日本鏡蛤; 丹東、贛榆地區(qū)鏡蛤D. corrugata（DDA）、D. corrugata（DDB）、D. corrugata（DDC）、D. corrugata（GY）聚為一支, 形態(tài)與薄片鏡蛤相似,為薄片鏡蛤; 贛榆地區(qū)鏡蛤D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）聚為一支, 形態(tài)與餅干鏡蛤相似,為餅干鏡蛤。分析表明餅干鏡蛤（D. biscocta）和日本鏡蛤（D. japonica）遺傳距離比較小, 二者之間有較近的親緣關系。本研究中未發(fā)現(xiàn)高鏡蛤（D. altior）的樣品, 至于高鏡蛤在中國北方潮間帶目前是否存在？其分類地位如何？這些還值得進一步研究。

表2 根據(jù)28S rRNA部分序列數(shù)據(jù)及Genbank登錄D. japonica、C. sinensis序列構建的遺傳距離Tab. 2 Pairwise sequence divergence for partial 28S rRNA fragments of tested samples and reference species,D. japonica and C. sinensis

表3 根據(jù)COI部分序列數(shù)據(jù)及Genbank登錄Cyclina sinensis序列數(shù)據(jù)構建的Pairwise遺傳距離Tab. 3 Pairwise sequence divergence for partial COI fragments of tested samples and reference species

3.2 中國北方沿海潮間帶常見鏡蛤的形態(tài)學分析

日本鏡蛤為中國北方沿海潮間帶常見種類[1～3]。本研究結果表明, 日本鏡蛤（D. japonica（WH）、D. japonica（HY））不同個體間形態(tài)差異和分子差異比較小, 其中28S序列分析中只出現(xiàn)一個單倍型, COI序列分析中出現(xiàn)2個單倍型。

餅干鏡蛤在所測樣品的28S rRNA、COI序列中均出現(xiàn)兩個單倍型D. biscocta（GYA）、D. biscocta（GYB）, 通過傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn), 兩個單倍型個體外套竇存在差異（圖5）。有的個體外套竇窄且先端尖（圖5A）, 有的個體外套竇寬且先端鈍圓[2]（圖5B）。

圖5 贛榆餅干鏡蛤兩種不同單倍型個體的外套竇形態(tài)比較Fig. 5 Two different kinds of pallial sinus ofDosinia biscoctafrom Ganyu

莊啟謙對薄片鏡蛤進行了詳盡的描述, 把薄片鏡蛤分為Dosinia corrugate、Dosinia corrugate（Penicillata型）、Dosinia corrugate（Trailli型）和Dosinia corrugate（Hanleyaba型）幾種不同的類型[2]。本研究發(fā)現(xiàn)薄片鏡蛤的不同個體存在形態(tài)和基因序列的差異, 所測得的樣品中28S rRNA出現(xiàn)兩個單倍型, COI基因序列中出現(xiàn)3個單倍型。通過傳統(tǒng)的形態(tài)學觀察發(fā)現(xiàn), 28S rRNA基因序列中的兩個單倍型個體的殼寬存在差異, 小個體D. corrugate（DDA）（圖 6 A）的殼寬反而大于大個體D. corrugata（DDB）（圖6 B）的殼寬。而且兩個體的小月面形狀也存在差異（圖6）,D. corrugata（DDB）的殼形在腹部中央偏后的部位略呈尖形[2], 符合對Dosinia corrugate（Penicillata型）的描述[2]。D. corrugata（DDA）（圖6 A）的外套竇略寬, 彎入特別深, 斜伸至貝殼近前方,先端略尖, 和記載中對Dosinia corrugate、Dosinia corrugate（Penicillata型）、Dosinia corrugate（Trailli型）、Dosinia corrugate（Hanleyaba型）[2]的描述都有所不同。因此對于遼寧丹東海區(qū)的D. corrugata（DD）有待作進一步的研究。

圖6 丹東薄片鏡蛤的兩個不同單倍型殼型和小月面形狀比較Fig. 6 Two different haploid genotype ofDosinella corrugatafrom Dandong

3.3 兩種不同聚類方法所得分子系統(tǒng)樹的差異分析

鑒于本研究所涉及的鏡蛤種類之間的堿基差異較小, 因此選擇最大簡約法（Maximum Parsimony methods, 簡稱 MP）和鄰位相連法（Neighbor-joining,簡稱NJ）進行分析。最大簡約法（MP）所得的進化樹的拓撲形狀是由序列上的每個堿基、氨基酸的狀態(tài)決定的（一個序列上包含多個酶切位點, 而每個酶切位點的存在與否是由幾個堿基的狀態(tài)決定的, 也就是說一個序列堿基的狀態(tài)決定著它的酶切位點狀態(tài),當多個序列進行進化樹分析時, 進化樹的拓撲形狀也就由這些堿基的狀態(tài)決定了）。鄰位相連法（NJ）所得進化樹拓撲結構的形成不同于 MP樹, 不是由序列堿基、氨基酸狀態(tài)決定的, 而是取決于兩兩序列的進化距離, 因此本研究中NJ樹的拓撲結構與MP樹拓撲結構存在較小差異。所得的兩種不同分子系統(tǒng)樹都進行了 Bootstrap檢驗?？傮w上, 兩種聚類方法所得分子系統(tǒng)樹的結果是一致的, 較真實地評估了中國北方沿海潮間帶常見鏡蛤（日本鏡蛤Dosinia japonica、薄片鏡蛤Dosinia corrugata、餅干鏡蛤Dosinia biscocta）的進化關系。

[1] 徐鳳山, 張素萍. 中國海產雙殼類圖志[M]. 北京:科學出版社, 2008. 235-239.

[2] 莊啟謙. 中國動物志. 軟體動物門, 雙殼綱, 簾蛤科[M]. 北京: 科學出版社, 2001. 133-158.

[3] Qi Z. Seashells of China [M]. Beijing: Ocean press.2004. 300-303.

[4] 徐鳳山. 中國海雙殼類軟體動物[M]. 北京: 科學出版社, 1997. 211-215.

[5] 王海艷. 中國近海常見牡蠣分子系統(tǒng)演化和分類的研究[D]. 青島:中國科學院海洋研究所博士論文,2004.

[6] 程漢良, 夏德全, 吳婷婷等. 6種簾蛤科貝類及4個地理種群文蛤線粒體 COI基因片段序列分析[J]. 海洋學報, 2007, 29（5）: 109-116.

[7] Kappner I, R Bieler. Phylogeny of venus clams（Bivalvia:Venerinae） as inferred from nuclear and mitochondrial gene sequences[J]. Molecular Phylogenetics and Evolution, 2006, 317-331.

[8] 陳麗梅, 孔曉瑜, 喻子牛等. 3種蟶類線粒體 16S rRNA和COI基因片段的序列比較及其系統(tǒng)學初步研究[J]. 海洋科學, 2005, 29（8）: 27-32.

[9] 鄭文娟, 朱世華, 沈錫全等. 泥蚶線粒體 COI和16SrRNA基因片段序列研究[J]. 寧波大學學報, 2008,21（1）: 39-42.

[10] 孔曉瑜, 姜艷艷, 相建海等. 魁蚶線粒體 16S rRNA和 COI基因片段序列測定及其應用前景[J]. 海洋科學, 2001, 25（12）: 46-48.

[11] 孔曉瑜, 劉亞軍, 喻子牛等. 牙鲆、石鰈和川鰈的線粒體16S rRNA基因片斷的序列比較研究[J]. 青島海洋大學學報, 2001, 31（5）: 713-717.

[12] 程雙懷, 席貽龍, 項賢領等. 基于 28S rDNA基因序列研究十種臂尾輪蟲的系統(tǒng)關系和分類地位[J]. 動物分類學報, 2007, 32（3）: 599-605.

[13] Park J K, Foighil D. Sphaeriid and Corbiculid clam represent separate heterodont bivalve radiations into freshwater environments [J]. Mol Phylogenet Evol ,2000, 14（1）: 75-88.

[14] Folmer O, Black M, Hoeh W,et a1. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome Coxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J]．Mol Mar Biol Biotechnol, 1994, 3: 294-299.

Received: May, 23, 2010

Key words:Dosinia; classification; COI; 28S rRNA

Abstract:To clarify the taxonomic status of commonDosiniafrom northern China, we collected and analyzed samples from four locations （Dandong, Yantai, Weihai, and Lianyungang） along north China’s coast using both morphological characters and DNA sequencing （nuclear 28S rRNA and mitochondrial COI sequence） data. The result suggests thatDosinia japonica, Dosinia corrugataandDosinia biscoctaare common species in intertidal areas of northern China, andD. biscoctaandD. japonicaare clustered closely. Morphology differences exist among individuals ofD. biscoctaof Lianyungang, as well asD. corrugataof Dandong. All of these samples need to be further investigated.

（本文編輯:梁德海）

Species of common Dosinia from intertidal zones of northern China

LIU Ze-hao1, LI Jie1, YANG Xue-ling3, WANG Hai-yan2, LI Yong-qiang1, ZHANG Su-ping2, XU Feng-shan2

（1. Qingdao Technological University, Qingdao 266033, China; 2. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China ; 3.Bureau of Animal Husbandry and Fisheries, Fianjin 301800, China）

Q959.1

A

1000-3096（2010）12-0030-06

2010-05-23;

2010-07-12

國家自然科學基金項目（40876084）; 海洋公益性行業(yè)科研專項經費項目（200805069）; 中國科學院海洋研究所知識創(chuàng)新前沿項目（2007-12）。

劉澤浩（1985-）, 男, 河北衡水人, 碩士, 研究方向: 海洋貝類分子系統(tǒng)分類, E-mail: adam004@163.com; 王海艷, 通信作者, 副研究員,研究方向: 海洋貝類分類及系統(tǒng)演化, E-mail: haiyanwang@ qdio.ac.cn