甘草和連翹對(duì)牙鲆CYP3A活性影響的研究

韓現(xiàn)芹, 李 健, 李吉濤

（1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島266071; 2. 國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 山東 青島 266071）

甘草和連翹對(duì)牙鲆CYP3A活性影響的研究

韓現(xiàn)芹1,2, 李 健1,2, 李吉濤1

（1．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 農(nóng)業(yè)部海洋漁業(yè)資源可持續(xù)利用重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島266071; 2. 國(guó)家水產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心, 山東 青島 266071）

研究甘草（Glycyrrhiza uralensis）和連翹（Forsythia suspensa）對(duì)牙鲆（Paralichthys olivaceus）肝細(xì)胞色素P4503A（CYP3A）活性的影響。將牙鲆隨機(jī)分為3組, 即對(duì)照組、甘草組和連翹組, 對(duì)照組每日口灌0.9%的生理鹽水, 試驗(yàn)組每日1次口灌甘草30 mg/kg和連翹100 mg/kg, 連續(xù)口灌6 d, 第7天時(shí), 采用直接測(cè)定法和間接測(cè)定法（探針?biāo)幬铮┻M(jìn)行CYP3A酶活性的測(cè)定。結(jié)果顯示: 在肝微粒體水平上, 甘草和連翹均可明顯提高紅霉素-N-脫甲基酶活性, 分別提高了1.79倍、4.87倍。與對(duì)照組相比, 甘草組和連翹組氨苯砜的半衰期分別降低了 4.51%（P＞0.05）和 36.8%（P＜0.01）; 藥時(shí)曲線下面積分別減小了

8.28%（P＞0.05）和32.3%（P＜0.01）; 總清除率分別增加了5.63%（P＞0.05）和99.3%（P＜0.01）。說(shuō)明連翹對(duì)牙鲆CYP3A的活性具有極顯著誘導(dǎo)作用, 甘草誘導(dǎo)作用不顯著。提示其他藥物與連翹合用時(shí), 其有效性和安全性可能會(huì)受到影響。

CYP3A 活性; 甘草（Glycyrrhiza uralensis）; 連翹（Forsythia suspensa）; 氨苯砜; 牙鲆（Paralichthys olivaceus）

細(xì)胞色素P450（CYP450）是肝臟混合功能氧化酶系（mixed function oxidase system, 簡(jiǎn)稱MFOS）的主要成分, 主要參與內(nèi)源性和外源性化合物代謝, 它也可被許多物質(zhì), 如治療藥物（如抗生素）、環(huán)境化合物及一些天然產(chǎn)物誘導(dǎo)或抑制[1], 已成為近年來(lái)藥理學(xué)、毒理學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。CYP3A是 CYP450超家族的主要成員, 現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)其參與 50%以上臨床常用藥物的代謝[2], 與之相關(guān)的藥物相互作用亦十分多見(jiàn)。該酶活性可以通過(guò)一些特異敏感底物來(lái)測(cè)定, 其中氨苯砜在體內(nèi)主要經(jīng) CYP3A代謝, 故可用其消除速率來(lái)反映 CYP3A活性。紅霉素-N-脫甲基酶（erythromycin N-demethylase, 簡(jiǎn)稱 ERND）是CYP3A標(biāo)志性酶, 也可以通過(guò)測(cè)定肝微粒體中ERND的多少, 獲悉肝微粒體中CYP3A酶的活性的大小。目前水產(chǎn)用藥物幾乎都是從獸藥或人用藥物直接移植而來(lái), 臨床用藥很少考慮 CYP450活性對(duì)藥物代謝的影響, 因而導(dǎo)致藥效的下降、中毒和殘留的現(xiàn)象, 進(jìn)而影響了動(dòng)物性食品安全。甘草（Glycyrrhiza uralensis）和連翹（Forsythia suspensa）是具有保肝護(hù)肝、清熱解毒等功效的傳統(tǒng)中藥, 已廣泛添加到水產(chǎn)飼料中, 起到了提高水產(chǎn)動(dòng)物免疫力、降低飼料系數(shù)的作用[3], 但對(duì)魚類CYP450活性的影響尚未報(bào)道。本試驗(yàn)通過(guò)研究氨苯砜及 ERND在牙鲆體內(nèi)含量的變化, 探討甘草和連翹對(duì)CYP3A酶活性影響的規(guī)律, 從而可為其合理用藥提出理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

牙鲆（Paralichthys olivaceus）, 平均體質(zhì)量（200±20.1）g, 平均體長(zhǎng)（24.5±3.2）cm, 4～5 尾/立方水體,飼養(yǎng)于中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所麥島實(shí)驗(yàn)基地。實(shí)驗(yàn)期間水溫（16±2）℃, 鹽度（30.4±0.2）,充氣, 流水, 試驗(yàn)前暫養(yǎng)2周, 每日投喂不含藥物的配合飼料（金海力海水魚配合飼料）, 實(shí)驗(yàn)前1 d停止投餌。為防飼料對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響, 實(shí)驗(yàn)期間不投餌。

1.2 藥品、試劑與儀器

生甘草、連翹購(gòu)于青島同仁堂藥店。氨苯砜原粉及標(biāo)準(zhǔn)品批號(hào): 美國(guó) Sigma公司產(chǎn)品, 20060608,純度≥99 %; 乙腈和甲醇: 德國(guó)默克公司產(chǎn)品, 色譜級(jí); 牛血清白蛋白純度＞99.8%, Amresco, 批號(hào)1105502; 紅霉素: 含量 85%; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭gilent 1100型高效液相色譜儀（配紫外吸收檢測(cè)器）; 96孔酶標(biāo)板。

中草藥提取液的制備: 取生甘草100 g加水500 mL, 用水浸泡 0.5～1 h, 加熱至沸騰, 煮沸后用文火煎0.5 h, 4層紗布過(guò)濾, 殘?jiān)由儆诘谝淮蔚乃逯?合并兩次濾液并濃縮, 使其質(zhì)量濃度相當(dāng)于原藥0.29 g／mL[4]。連翹提取液制備方法同上, 濃縮后所得質(zhì)量濃度為0.24 g／mL。

1.3 給藥及樣品采集

將健康牙鲆隨機(jī)分為3組, 分別為: （1）正常對(duì)照組（0.9%生理鹽水）; （2）甘草組 30 mg/kg; （3）連翹組100 mg/kg?？诠嗝刻?次, 無(wú)回吐者保留試驗(yàn)連續(xù)6 d, 于第7天, 從3組中各取10尾魚, 迅速解剖取出肝臟, 保存于液氮中。

然后對(duì)3組剩余牙鲆進(jìn)行腹腔注射5 mg/kg探針?biāo)幬锇北巾? 分別于注射給藥后 0.083, 0.167, 0.25,0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, 6, 8, 12 h共13個(gè)時(shí)間點(diǎn)靜脈取血。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)每組隨機(jī)取 5尾從尾靜脈一次性無(wú)菌采血 1 mL, 分別置于預(yù)先涂有肝素鈉的離心管中,4 000 r/min離心5 min, 分離出血漿, 保存于?20℃冰箱中待測(cè)。

1.4 血漿中氨苯砜的測(cè)定

1.4.1 血漿樣品的預(yù)處理

將血漿自然解凍, 搖勻, 吸取0.2 mL于1.5 mL具塞離心管中, 加入乙腈 0.3 mL, 置漩渦混合器上充分混合, 12 000 r／min離心10 min, 取上清液20μL進(jìn)行HPLC分析[5]。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為 Agilent Tc-C18（250 mm×4.6 mm,5μm）, 柱溫 30℃, 流動(dòng)相為乙腈-磷酸二氫鉀緩沖液（pH=3.55）（40 : 60, V/V）, 流速為1.0 mL/min, 檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm, 一次進(jìn)樣量20 μL。

1.4.3 方法學(xué)試驗(yàn)

1.4.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血漿0.25 mL置于1.5 mL離心管中, 加入不同濃度的氨苯砜標(biāo)準(zhǔn)溶液0.25 mL, 使其終質(zhì)量濃度分別為0.01, 0.02, 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 1, 5, 10 mg/L,然后按“1.4.1”方法操作, 每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)定5次。以平均峰面積為縱坐標(biāo), 質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)做氨苯砜濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線, 求出回歸方程和相關(guān)系數(shù)。

1.4.3.2 回收率的測(cè)定

取空白血漿, 分別加入氨苯砜標(biāo)準(zhǔn)溶液, 制成含氨苯砜 0.25, 2.5, 10 mg/L 3個(gè)質(zhì)量濃度的血樣,按樣品方法處理后進(jìn)行測(cè)定, 每一濃度設(shè)5個(gè)重復(fù)。獲得各樣品的峰面積, 再按血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算得氨苯砜的濃度值, 并與原來(lái)加入量比較, 計(jì)算方法回收率。即:

1.4.3.3 方法精密度測(cè)定

將上述 0.25, 2.5, 10 mg／L氨苯砜血樣, 按“1.4.1”方法處理后進(jìn)行測(cè)定, 每一濃度設(shè) 5個(gè)重復(fù)。每個(gè)濃度日內(nèi)測(cè)定5次, 日間測(cè)定5次, 計(jì)算日內(nèi)變異和日間變異。

1.5 ERND活性測(cè)定

1.5.1 肝微粒體懸液的制備

取出肝臟, 除去脂肪和結(jié)締組織, 用冰涼的0.9%生理鹽水漂洗3次, 洗凈血污, 濾紙吸干、稱質(zhì)量、將肝轉(zhuǎn)入小燒杯, 用剪刀剪碎肝臟, 轉(zhuǎn)入預(yù)冷的手動(dòng)玻璃Potter勻漿器。按1 : 5（W/V）的比例加入冰冷的勻漿緩沖液, 置冰浴中制成勻漿。先加入3 mL/g勻漿緩沖液, 上、下8次, 制成肝勻漿, 轉(zhuǎn)移到離心管中, 再用2 mL勻漿緩沖液倒入勻漿器中沖洗, 合并兩次溶液, 混勻。所有操作均在4℃下進(jìn)行。勻漿液先以10 000 g, 2℃離心30 min, 棄去沉淀, 取上清液, 即得肝微粒體（MS）, 即 S9部分[6], 分裝于離心管中, ?80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 肝微粒體蛋白濃度測(cè)定（BCA法）

1.5.2.1 用牛血清蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線

BCA試劑分A、B兩部分, 使用前按A:B=50:1的比例配制成BCA試劑工作液。各取質(zhì)量濃度為0.5 g/L的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液0, 2, 4, 8, 16, 20, 24, 32, 40μL, 補(bǔ)充標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液至40 μL。加200 μL BCA試劑工作液; 混勻后 37℃放置 30 min, 以不含蛋白的試劑為空白對(duì)照, 562 nm處比色。以系列濃度的牛血清蛋白為橫坐標(biāo), OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線, 進(jìn)行線性回歸, 求得牛血清蛋白濃度線性回歸方程。

1.5.2.2 微粒體樣品蛋白濃度測(cè)定

將微粒體蛋白樣品稀釋10倍, 取40 μL稀釋液加200 μL BCA試劑工作液, 其余步驟同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作, 測(cè)定各樣品的OD值, 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線及稀釋倍數(shù)計(jì)算樣品蛋白濃度, 并換算成每克肝中所含的微粒體蛋白含量。

1.5.3 ERND活性測(cè)定

1.5.3.1 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

先取甲醛溶液0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 mL, 根據(jù)情況設(shè)定, 用蒸餾水補(bǔ)足至2 mL（此時(shí)各試管甲醛終量濃度為: 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 nmol/mL。再加Nash試劑2 mL, 60℃水浴10 min, 取出后自來(lái)水冷卻5 min。以空白管調(diào)零, 在420 nm處測(cè)OD值。以甲醛終濃度為縱坐標(biāo), OD值為橫坐標(biāo)制作甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.3.2 ERND活性測(cè)定

取0.1 mol/L PBS（pH7.4）1.7 mL, 加微粒體蛋白懸液0.1 mL, 紅霉素0.1 mL, 25 ℃水浴溫孵2 min后, 測(cè)定管加10 mmol/L還原型輔酶Ⅱ（nicotinamide adenine dinucleotide 2'-phosphate,簡(jiǎn)稱 NADPH） 0.1 mL, 空白管加蒸餾水0.1 mL, 25 ℃水浴30 min。各管均加 ZnSO40.35 mL, 混勻, 冰浴 5 min, 加飽和Ba（OH）220.35m L, 混勻, 室溫放置5 min后, 11 000 r/min, 離心10 min, 取上清液2 mL, 加Nash試劑2 mL, 60 ℃水浴10 min, 拿出后再冷卻5 min, 測(cè)酶活。

1.5.3.3 酶活計(jì)算

以每毫克蛋白質(zhì)每分鐘使甲醛增加的量表示酶活性。計(jì)算公式:

甲醛 （HCHO） nmol/（mg·min）=（OD酶管－OD非酶管）×K×4/10 min（K 為從標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得 OD, 相當(dāng)于HCHO nmol/L數(shù)）

1.6 數(shù)據(jù)分析與處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示, 將所得的藥物濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)采用藥代動(dòng)力學(xué)專用軟件DAS2.1.1軟件處理, 分別按一、二和三室模型擬合藥動(dòng)學(xué)參數(shù), 選擇最佳房室模型, 計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù), 通過(guò)SPSS13.0軟件進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 探針?biāo)幬锇北巾块g接測(cè)定

2.1.1 色譜分析

在上述的色譜條件下, 基線平穩(wěn), 藥峰與雜峰分離良好, 氨苯砜的保留時(shí)間穩(wěn)定, 出峰時(shí)間在10.105 min, 無(wú)干擾峰出現(xiàn)。圖1分別是空白血漿、空白血漿加入氨苯砜和體內(nèi)注射氨苯砜后的色譜行為。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、回收率與精密度

在本試驗(yàn)液相色譜條件下, 將空白血漿加入相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液, 預(yù)處理后進(jìn)行HPLC分析, 計(jì)算氨苯砜峰面積（A）對(duì)氨苯砜的濃度（C）進(jìn)行線性回歸, 氨苯砜 回 歸 方 程 為 A=1006.735C?18.121 （n=5, r=0.9999）。結(jié)果表明: 血漿中的氨苯砜在 0.01～10 mg／L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積之間的相關(guān)性好, 血漿中氨苯砜的最低檢測(cè)限為 0.01 mg／L, 信噪比（Signal/Noise, 簡(jiǎn)稱S/N）＞3。氨苯砜低、中、高（0.25,2.5, 10 mg／L）3種質(zhì)量濃度的血漿樣品的回收率在94.0%～99.2%, 日內(nèi)變異和日間變異系數(shù)均＜5%,符合生物樣品測(cè)定要求。

2.1.3 甘草和連翹對(duì)氨苯砜血藥濃度的影響

對(duì)照組、甘草組和連翹組的牙鲆腹腔注射探針?biāo)幬锖? 測(cè)得的血漿濃度如圖2所示, 甘草組和連翹組各時(shí)間點(diǎn)氨苯砜的平均血藥濃度均低于對(duì)照組。

2.1.4 甘草和連翹對(duì)牙鲆體內(nèi)氨苯砜藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)經(jīng)藥代動(dòng)力學(xué)專用軟件DAS2.1.1處理, 分別用單室、雙室、三室模型進(jìn)行擬合后, 氨苯砜同二室模型相吻合, 權(quán)重為 1/C/C, 其主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

圖1 空白血漿（A）、加入氨苯砜的標(biāo)準(zhǔn)血漿（B）和體內(nèi)注射氨苯砜后的樣品血漿（C）的色譜Fig. 1 Representative HPLC chromatograms of （A） blank fish plasma, （B） plasma spiked with dapsone standard, and （C）plasma sample after injections of dapsone

和對(duì)照組相比, 甘草組和連翹組氨苯砜的消除半衰期（t1/2β）分別降低了 4.51%（P＞0.05）和 36.8%（P＜0.01）; 藥時(shí)曲線下面積（area under the concentrationtime curve, 簡(jiǎn)稱 AUC）分別減小了 8.28%（P＞0.05）和32.3%（P＜0.01）總清除率（the total body clearance, 簡(jiǎn)稱CL）分別增加了 5.63%（P＞0.05）和 99.3%（P＜0.01）。

表1 甘草和連翹對(duì)牙鲆單次腹腔注射氨苯砜（10mg/kg）后主要藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響（n=5）Tab. 1 Effects of Glycyrrhiza uralensis or Forsythia suspense on main pharmacokinetic parameters of dapsone after a single intraperitoneal administration at 5mg/kg to Paralichthys olivaceus （n=5）

圖 2 甘草和連翹對(duì)牙鲆單次腹腔注射氨苯砜（5mg/kg）后血藥濃度的影響（n=5）Fig. 2 Plasma concentrations of Glycyrrhiza uralensis or Forsythia suspensa after single intraperitoneal administration in dapsone at 5mg/kg（n=5）

2.2 紅霉素-N-脫甲基酶活性

2.2.1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

BCA法測(cè)定肝微粒體蛋白質(zhì)含量。以系列濃度牛血清白蛋白為橫坐標(biāo), 相應(yīng)的 Y 值（OD 值）為縱坐標(biāo), 得線性回歸方程為Y＝1.5806X＋0.1488, 相關(guān)系數(shù)r＝0.995。該方法的檢測(cè)范圍為0.01～0.05 mg/L,最低檢測(cè)限為0.01 mg /L。

2.2.2 甲醛標(biāo)準(zhǔn)曲線

以系列濃度的甲醛為橫坐標(biāo), 相應(yīng)的 OD值為縱坐標(biāo), 得線性回歸方程為 y＝3.0191x＋0.0195, 相關(guān)系數(shù) r＝0.9996。該方法中甲醛為 0.10～0.80 μmol/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與 OD值有良好的線性關(guān)系, 最低檢測(cè)限為0.10μmol/L。

2.2.3 甘草和連翹對(duì)牙鲆肝微粒體蛋白濃度和ERND活性的影響

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2003軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）形式表示,用t檢驗(yàn)（Student’s t-test）進(jìn)行平均數(shù)間的差異顯著性分析。牙鲆經(jīng)甘草和連翹處理后, 其蛋白濃度和ERND活性測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 兩種藥物對(duì)牙鲆紅霉素-N-脫甲基酶活性的影響Tab. 2 Effect of the two drugs on erythromycin N-demethylase activity in Paralichthys olivaceus（n=10）

3 討論

3.1 氨苯砜色譜條件的優(yōu)化

三乙胺可以較好地改善峰形, 防止脫尾, 經(jīng)過(guò)反復(fù)實(shí)驗(yàn), 三乙胺的加入量以0.2 mol/L為最好。在所選擇流動(dòng)相條件下, 保留時(shí)間適當(dāng), 峰形良好, 且與雜峰具有較好的分離度。

在血漿樣品預(yù)處理方法的選擇上, 對(duì)有機(jī)溶劑萃取法“加氯仿-離心-取有機(jī)相-氮?dú)獯蹈?流動(dòng)相溶解-進(jìn)樣”和“加乙腈-取上清-進(jìn)樣”進(jìn)行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),單純用乙腈時(shí)對(duì)血漿蛋白的清除更為徹底, 能獲得非常清澈的無(wú)蛋白上清液。由于減少了氮?dú)獯蹈蓾饪s、復(fù)溶等多個(gè)步驟, 該方法不僅極大地降低了工作強(qiáng)度,而且操作步驟少, 可直接應(yīng)用外標(biāo)法進(jìn)行分析, 減輕了使用內(nèi)標(biāo)法定量分析對(duì)分辨率的要求。

流動(dòng)相 pH和乙腈濃度對(duì)氨苯砜的分離均有一定影響, 為此進(jìn)行了優(yōu)化試驗(yàn)。對(duì)上述2因素各取5水平流動(dòng)相pH值: 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5; 乙腈含量: 45%,40%, 35%, 30%, 25%進(jìn)行研究。結(jié)果表明, 影響峰形的是流動(dòng)相 pH, 在 pH3.5時(shí)出的峰比較尖銳, 無(wú)托尾或前延現(xiàn)象。影響出峰時(shí)間主要是乙腈濃度, 在25%～45%乙腈濃度范圍內(nèi), 乙腈比例提高 5%, 其保留時(shí)間可縮短0.826 min左右。因考慮到前5 min內(nèi)有雜峰出現(xiàn), 盡量保證在5 min后出峰, 因此選用最佳組合流動(dòng)相pH3.5, 乙腈比例40%作為色譜條件。

3.2 甘草和連翹對(duì)牙鲆肝微粒體中 ERND活性的影響

目前, 國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究主要集中在環(huán)境污染物對(duì)魚類CYP450的影響, 關(guān)于魚類CYP450在藥理學(xué)中的研究?jī)H見(jiàn)于氟苯尼考、喹酸和氟甲喹等漁藥口服給藥后對(duì)魚類 CYP450活性的影響[7,8], 但關(guān)于中藥對(duì)魚類 CYP450的研究在國(guó)內(nèi)外尚屬空白。近年來(lái)在人和鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上有關(guān)中草藥對(duì) CYP450影響的報(bào)道逐漸增多, 如葛根（Pueraria lobata）、梔子（Gardenia jasminoides）、甘草（Glycyrrhiza uralensis）、人參（Panax notoginseng）、黃芩（Scutellaria baicalensis）等及其單體化合物黃芩苷、梔子苷、甘草甜素等都對(duì)P450酶有調(diào)控作用。

CYP3A是肝臟混合功能氧化酶系的主要成分,在內(nèi)源性和外源性化合物的生物轉(zhuǎn)化中起重要作用。魚類的CYP450主要位于肝內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜, 也少量存在于鰓、腎、心等肝外組織[9], 相關(guān)研究已證實(shí)了魚類 CYP3A基因的存在[10], 紅霉素 N-脫甲基酶是反映CYP3A活性的標(biāo)志酶。

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得對(duì)照組的肝微粒體蛋白含量為7.076±0.47 mg/g肝質(zhì)量, 與陳大健[7]報(bào)道的鯽魚肝微粒體蛋白含量 5.238mg/g±0.397 mg/g肝質(zhì)量基本相吻合。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到牙鲆的紅霉素-N-脫甲基酶活性為 0.0567 nmol/（mg?min）±0.0038 nmol/（mg?min）,和 Vaccaro等[11]在用作對(duì)照的未作任何處理的舌齒鱸（Dicentrarchus labrax）上測(cè)得的活性 1.162 nmol/（mg?min）±0.200 nmol/（mg?min）相比稍低, 但和哺乳動(dòng)物的該酶活性相比都相對(duì)較低, 可能與哺乳動(dòng)物CYP3A占 P450總量的比例最高相關(guān)。很多研究表明, CYP3A也是魚類消化道和呼吸道表達(dá)的主要CYP450組分。而實(shí)際水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 魚類的用藥方式亦幾乎都是通過(guò)消化道途徑。因此, 可以推測(cè)CYP3A也可能在魚類口服藥物的首過(guò)消除中起著主要作用。

由表2可以看出, 和對(duì)照組相比, 甘草組和連翹組 ERND活性明顯升高, 分別提高了 1.79倍、4.87倍, 差異極顯著, 說(shuō)明甘草和連翹對(duì) CYP3A的活性有極顯著的誘導(dǎo)作用。與譚毓治等[12]報(bào)道的甘草主要活性成分甘草酸能誘導(dǎo)小鼠肝微粒體P450水平使其含量及活性增加的結(jié)果相符合。

3.3 探針?biāo)幬锓ㄩg接評(píng)價(jià)甘草和連翹對(duì)牙鲆CYP3A活性的影響

本實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)是通過(guò)探針?biāo)幬锇北巾康拇x速率間接反映了受試藥物對(duì)CYP3A活性的影響, 國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有利用探針?biāo)幬镅芯眶~類CYP3A活性的文獻(xiàn)報(bào)道。目前哺乳動(dòng)物上用于測(cè)定體內(nèi)CYP3A活性的常用探針?biāo)幬镉? 氨苯砜[13]、咪達(dá)唑侖[14]和紅霉素[15]。因紅霉素與可的松的實(shí)驗(yàn)條件比較苛刻, 需避光操作, 所以選擇氨苯砜作為檢測(cè)CYP3A酶活性的探針?biāo)幬铩?/p>

研究結(jié)果表明: 對(duì)照組牙鲆氨苯砜的t1/2β為13.301 h, 而胡屹屹等[5]報(bào)道的在豬體內(nèi)氨苯砜的t1/2β為 4.205 h, 可見(jiàn)魚和哺乳動(dòng)物的t1/2β差異很大,說(shuō)明同種藥物在不同物種中的消除時(shí)間存在較大差異。在哺乳動(dòng)物內(nèi)CYP3A占P450總量的比例最高,是參與口服藥物首過(guò)效應(yīng)的主要酶系, 在肝微粒體水平上實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明CYP3A標(biāo)志性酶ERND活性比哺乳動(dòng)物低得多, 所以哺乳動(dòng)物代謝氨苯砜的速率相對(duì)來(lái)說(shuō)比較快。

口灌甘草6 d后, 氨苯砜的t1/2β、CL和AUC分別為12.701 h、0.150 kg /（L?h）和16.121 mg/（L?h）, 與對(duì)照組比較,t1/2β減小了4.51%, CL增加了5.63%, AUC減小了8.28%,與對(duì)照組比較差異不顯著, 說(shuō)明對(duì)牙鲆血漿中氨苯砜的代謝率沒(méi)有顯著影響, 這可能意味著甘草對(duì)CYP3A的誘導(dǎo)作用不強(qiáng)。而文獻(xiàn)報(bào)道[12]的高劑量甘草（490 mg/kg）對(duì)小鼠肝藥酶有顯著誘導(dǎo)作用, 說(shuō)明誘導(dǎo)作用強(qiáng)弱可能與劑量有關(guān)。高同銀等[16]認(rèn)為甘草甜素及水解后生成的葡萄糖醛酸具有保肝解毒和誘導(dǎo)藥酶加工處理毒物之功能。據(jù)報(bào)道[17], 甘草還明顯表現(xiàn)出對(duì)CYP1A2的誘導(dǎo)作用。說(shuō)明同種藥物可以影響多個(gè)CYP450亞酶活性, 提示其在與CYP酶代謝有關(guān)的藥物合用時(shí), 應(yīng)充分考慮其對(duì)酶影響的差異, 以避免可能的毒性或不良反應(yīng)。

連翹組氨苯砜的t1/2β、CL和AUC分別為8.401 h、0.283 kg /（L?h）和 11.900 mg/（L?h）, 與對(duì)照組比較,t1/2β減小了 36.8%; CL增加了 99.3%; AUC減小了32.3%, 牙鲆的代謝和排泄加快, 表明連翹對(duì)牙鲆CYP3A活性具有顯著的誘導(dǎo)作用。與閆淑蓮[18]報(bào)道的用連翹對(duì)大鼠CYP3A有誘導(dǎo)作用的結(jié)論相符。據(jù)報(bào)道[19]給予連翹提取物可使大鼠 CYP3A的活性增加1倍,人體內(nèi)也有相似的結(jié)果[20]。這與在肝微體水平上, 甘草和連翹對(duì)牙鲆CYP3A有誘導(dǎo)作用的結(jié)果基本是一致的。孕烷受體（pregnane X receptor, 簡(jiǎn)稱PXR）是 CYP3A 基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄活化因子, 調(diào)節(jié)CYP3A和其他酶及轉(zhuǎn)運(yùn)體的表達(dá), CYP3A誘導(dǎo)作用與 PXR結(jié)合有關(guān)[21,22]。CYP3A的種屬差異與 PXR分子結(jié)構(gòu)的不同有關(guān), 在哺乳動(dòng)物中, CYP3A的誘導(dǎo)機(jī)制由親脂性的化學(xué)物包括激素等激活PXR參與的[23,24]。

為了增強(qiáng)治療效果, 臨床上中藥常與抗菌藥結(jié)合使用, 一些中藥和西藥之間的相互作用逐漸引起人們的關(guān)注。甘草是肝藥酶誘導(dǎo)劑, 據(jù)張錦楠[25]報(bào)道,服用甘草的大鼠肝微粒體P450水平顯著升高, 使丙咪嗪、氨茶堿、安替比林[26]合用時(shí), 使后者代謝加速,半衰期縮短、藥效減弱。還有諸多文獻(xiàn)報(bào)道大劑量甘草及其制劑與四環(huán)素、紅霉素、氯霉素等抗生素聯(lián)用, 可降低這些藥物的吸收率[27]。其誘導(dǎo)機(jī)制可能是多方面的, 確切機(jī)制尚需做大量甘草單體成分等研究工作據(jù)報(bào)道。

近年來(lái), 抗生素、殺蟲劑、激素等非營(yíng)養(yǎng)性藥物添加劑在配合飼料中長(zhǎng)期使用, 導(dǎo)致養(yǎng)殖產(chǎn)品藥物殘留增加, 進(jìn)而危害動(dòng)物和人體的健康。中草藥飼料添加劑藥源豐富, 在動(dòng)物體內(nèi)毒副作用低, 集營(yíng)養(yǎng)保健、預(yù)防疾病和促進(jìn)生長(zhǎng)于一體。中藥就其物質(zhì)基礎(chǔ)而言是大量單體化合物的混合物, 起藥理作用的是其主要的活性成分, 因而同樣面臨著肝 CYP對(duì)它的氧化代謝作用。由于甘草和連翹作為添加劑無(wú)形中和藥物聯(lián)合使用越來(lái)越普遍, 研究中草藥對(duì)CYP450酶活動(dòng)影響, 特別是代謝大多數(shù)藥物的CYP3A家族的影響研究, 不但可以為合理使用中藥提供理論依據(jù), 還可為中藥與中藥間的相互作用及中西藥物的合理配伍應(yīng)用, 提供具體指導(dǎo)原則。

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Received: Dec., 24, 2009

Key words:CYP3A activity; Glycyrrhiza uralensis; Forsythia suspensa; Dapsone; Paralichthys olivaceus

Abstract:The effects of Glycyrrhiza uralensis （GU） and Forsythia suspense （FS） on activities of cytochrome CYP3A in Paralichthys olivaceus were studied. Fishes were divided into three groups as follows: GU and FS group were administered orally for six days at 30mg/kg·bw and 100mg/kg·bw, respectively; fish in the control group were given an equal volume of normal saline （0.9%）. Seven day after the injection, the activities of CYP3A were measured directly and indirectly. We found that on the level of liver microsomes, GU and FS both increased erythromycin N-demethylase activity significantly by 1.79 times and 4.87 times respectively. Compared with the normal saline-treated control group, metabolism of dapsone in FS and GU group were higher than that in the control group,the elimination half -lives were shortened by 4.51% （P＞0.05） and 36.8% （P＜0.01）, respectively. Area under the concentration-time curve were shortened by 8.28% （P＞0.05） and 32.3% （P＜0.01）, respectively; and the total body clearances were increased by 5.63% （P＞0.05） and 99.3% （P＜0.01）, respectively. The results showed that GU and FS can significantly induced the activity of CYP3A; and the induction effect of FS is higher than GU. A drug’s efficacy and safety may be affected by other drugs used concomitantly.

（本文編輯:譚雪靜）

Effects of Glycyrrhiza uralensis and Forsythia suspensa on cytochrome CYP3A in Paralichthys olivaceus

HAN Xian-qin1,2, LI Jian1,2, LI Ji-tao1

（1. Key Laboratory of Sustainable Utilization of Marine Fishery Resources of the Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Science, Qingdao 266071, China; 2. National Center for Quality Supervision and Test of Aquatic Products, Qingdao 266071, China）

S948

A

1000-3096（2010）12-0019-07

2009-12-24;

2010-01-13

公益性行業(yè)專項(xiàng) （nyhyzx07-046）; 國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30700617）

韓現(xiàn)芹（1981-）, 女, 碩士生, 主要從事魚類藥物代謝與殘留檢測(cè)研究, 電話: 13553086082, E-mail: xianqinhan@yahoo.com.cn; 李健, 通信作者: 電話: 0532-85830183, E-mail: Lijian@ysfri.ac.cn