禽蛋中泰樂菌素殘留量的微生物學檢測方法

瑪爾江·木坎 庫麗扎達·木拉提

試樣經(jīng)加水均質(zhì)、離心后取上清液，進行杯碟法測定。利用被測樣液中的泰樂菌素殘留量與藤黃微球菌的作用產(chǎn)生抑菌圈，根據(jù)產(chǎn)生抑菌圈的大小用標準曲線法進行定量測定。

1 試劑和材料

1.1 緩沖液（pH值8.0±0.1）

稱取13.3 g無水磷酸二氫鉀加入900 ml水溶解，再加入100 ml 6.2%氫氧化鉀溶液，混勻，于121℃高壓滅菌15 min。

1.2 生理鹽水

稱取8.5 g氯化鈉，溶于1 000 ml水中，于121℃高壓滅菌15 min。

1.3 泰樂菌素標準品

1 006 μg/mg，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供。

1.4 泰樂菌素標準儲備液

稱取適量的泰樂菌素標準品，先用少量甲醇溶解，再加水至 1 000 ml,使其濃度達 1 000 μg/ml，置 4 ℃冰箱保存，可使用8 d。

1.5 泰樂菌素標準工作液

吸取一定量泰樂菌素標準儲備液，分別用緩沖液稀釋成濃度為 0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/ml的標準工作液。需當天配制和使用。

1.6 培養(yǎng)基

1.6.1 培養(yǎng)基Ⅰ（pH值6.1±0.1）

蛋白胨10.0 g，牛肉浸膏5.0 g，氯化鈉2.5 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 000 ml，分裝于試管或克氏瓶中，于121℃高壓滅菌15 min；滅菌后可制成斜面。

1.6.2 培養(yǎng)基Ⅱ（pH值7.0±0.1）

蛋白胨 10.0 g，牛肉浸膏 5.0 g，氯化鈉 2.5 g，加蒸餾水至1 000 ml，分裝于試管中，于121℃高壓滅菌15 min。

1.6.3 培養(yǎng)基Ⅲ（pH值8.5±0.05）

蛋白胨6.0 g，牛肉浸膏1.5 g，酵母浸膏3.0 g，葡萄糖1.0 g，胰水解酪蛋白4.0 g，瓊脂15.0 g，加蒸餾水至1 000 ml，分裝于錐形瓶中，于121℃高壓滅菌15 min。

1.7 試驗菌種

藤黃微球菌CMCC（28001）由中國生物藥品檢定所提供。

2 儀器和設(shè)備

牛津杯：不銹鋼小管，外徑（8.0±0.1）mm，內(nèi)徑（6.0±0.1）mm，高（10±0.1）mm。培養(yǎng)皿：直徑約 90 mm，底部平整光滑的玻璃皿或塑料皿，具陶瓦蓋。ZY-300Ⅳ多功能微生物自動測量分析儀。均質(zhì)器：不低于10 000 r/min。離心機：不低于8 000 r/min。培養(yǎng)相：（36±1）℃，擱板應(yīng)保持水平。高壓滅菌器，恒溫水浴鍋：（恒溫±1℃）。

3 方法

3.1 樣液制備

將試樣均質(zhì)1 min（5 000 r/min）后，再稱取20 g于離心管內(nèi)，加入5 ml水，充分攪勻，放置60 min后，離心20 min（8 000 r/min），取上清液作為樣液。

3.2 菌懸液的制備

用約3 ml培養(yǎng)基Ⅱ?qū)⑴囵B(yǎng)基Ⅰ試管斜面上的藤黃微球菌培養(yǎng)物洗下，并移種到克氏瓶中的100 ml培養(yǎng)基Ⅰ的表面上，用滅菌玻璃珠使其均勻地鋪于整個表面，在36℃培養(yǎng)24 h后，用約15 ml滅菌生理鹽水洗下瓊脂表面的培養(yǎng)物，制成菌懸液，置4℃冰箱中可保存2周。

3.3 檢定用平板的制備

在測定前，需進行預(yù)測試驗，以求得菌懸液最佳用量。用0.1 μg/ml泰樂菌素標準工作液對加有不同量的菌懸液的平板進行測試，經(jīng)培養(yǎng)后能使0.1 μg/ml標準工作液在平板上產(chǎn)生直徑大于或等于10 mm清晰、完整的抑菌圈的菌懸液用量為最佳用量。注入10 ml熔化的培養(yǎng)基Ⅲ于滅菌培養(yǎng)皿內(nèi)，水平靜止，使其凝固，再于已熔化并冷卻至45～50℃的同一培養(yǎng)基內(nèi)，加入最佳用量的菌懸液使之充分混合后，取約4 ml注入上述已鋪有培養(yǎng)基Ⅲ的平板上，保持水平，使其凝固，所用平板需當天制備。

4 標準曲線回歸方程

用泰樂菌素標準工作液制備標準曲線，以0.2 μg/ml濃度的標準工作液為參考濃度，以0.05 μg/ml濃度的標準工作液作陰性對照，每個標準工作液濃度取3個檢定用平板作為一組，每個平板上置4個牛津杯，使牛津杯在半徑為2.5 cm的圓面呈90°角間距，對角兩個杯中加入0.2 μg/ml參考濃度標準工作液，另兩個對角杯中加入另一種濃度的標準工作液。4個濃度標準工作液共12個檢定平板，用于標準曲線。其中0.2 μg/ml參考濃度的標準工作液將得到24個抑菌圈直徑的數(shù)值，而其他標準工作液分別得到6個抑菌圈直徑的數(shù)值。蓋好陶瓦蓋，置（36±1）℃培養(yǎng)18 h。翻轉(zhuǎn)平板，取出牛津杯，精確地測量各個濃度產(chǎn)生的抑菌圈直徑，求得各自的平均值，再求出0.2 μg/ml參考濃度24個抑菌圈直徑的平均值。

4.1 回收率試驗

取空白禽蛋精密稱取3份各20.0 g，分別加入濃度為 100 μg/ml標準液 0.5、1.0、2.0 ml，得到添加最終濃度為 8.00、4.00、2.00 μg/ml的添加陽性禽蛋，回收率計算公式：

4.2 重復(fù)性試驗

取添加陽性試料(添加終濃度分別為2.00、4.00、8.00 μg/ml)各3份，按3.1節(jié)方法進行操作，每個濃度至少做3次重復(fù)，每次都要同時做標準曲線。

樣品中泰樂菌素殘留量計算公式為：

式中：X——試樣中泰樂菌素的殘留量（mg/kg）；

c——從標準曲線上查出的樣液中泰樂菌素的濃度(μg/ml)；

m——每毫升最終樣液所代表的試樣量(g/ml)。

5 結(jié)果

5.1 線性關(guān)系

標準曲線回歸方程為 y＝9.475 7x-14.049，r＝0.998 2，其中x為抑菌圈直徑，y為10倍泰樂菌素溶液濃度的對數(shù)值。結(jié)果表明，泰樂菌素在0.1～0.8 μg/ml的濃度范圍內(nèi)，抑菌圈直徑與效價濃度的對數(shù)值呈良好的線性關(guān)系，見表1。

表1 線性試驗結(jié)果

5.2 回收率和重復(fù)性試驗（見表2）

試驗證明泰樂菌素在禽蛋中的回收率,達到殘留檢測方法要求的80%，檢出重復(fù)性良好。

6 討論與小結(jié)

①注意樣品的污染。在測定抗生素殘留量時，樣品中抗生素溶液的濃度非常低，因此，取處理樣液時要避免樣品的損失，測定時所用的試驗器具應(yīng)嚴防抗生素殘留和污染。

表2 泰樂菌素在禽蛋中的回收率和重復(fù)性試驗結(jié)果

②在進行菌層預(yù)測試驗時，試驗用的菌種應(yīng)保持新鮮、純潔，菌種的活性，對抗生素反應(yīng)靈敏，菌種對測定影響很大，若菌種不適合，將得不出正確的結(jié)果，菌種不新鮮影響生長速度及靈敏度，一般使用第三代菌種為佳。

③試驗用培養(yǎng)基的靈敏度應(yīng)高，應(yīng)嚴格控制培養(yǎng)基的靈敏度。

④培養(yǎng)溫度對菌種的生長和抑菌圈所致的直徑大小有影響，32℃培養(yǎng)時菌層稀薄，顏色淺，抑菌圈邊緣不清晰，36～37℃培養(yǎng)時菌層密實，顏色顯黃，抑菌圈邊緣清晰。

⑤本文通過調(diào)解菌懸液和培養(yǎng)基的使用量，完全可以是0.1 μg/ml的泰樂菌素標準液產(chǎn)生大于10.0 mm的抑菌圈，所以本法的靈敏度能滿足農(nóng)業(yè)部規(guī)定部頒標準的檢測要求。

[1]中國獸藥典委員會.中華人民共和國獸藥典一部[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2005（附錄）：103-109.

[2]張治錟.抗生素藥品檢驗[M]（第1版）.北京：人民衛(wèi)生出版社，1987.

[3]中華人民共和國進出口商品檢驗行業(yè)標準SN0670—1997.