檸檬醛對繩狀青霉抑制作用研究

程嬋娟，韋 偉，胡尚勤

（重慶師范大學生命科學學院，重慶 400047）

檸檬醛（Citral）是從樟科（Lauraceae）植物山蒼子[Litsea cubeba（Lour）Per]果實、根及葉所提取精油中一種主要成分，具有廣譜的抗菌性[1-2]。目前就檸檬醛對白色念珠球菌（Candida albicans）、黃曲霉（Asperillus flavus）的抑菌作用和抑菌機理方面有較深入的研究[3-5]。并報道其對念珠菌、毛癬菌、曲霉菌、金黃色葡萄球菌、淋球菌和大腸桿菌等真菌和細菌均有抑制和殺滅的作用[5-7]。

繩狀青霉（Penicillium funiculosum）屬半知菌綱（Deuteromycetes），是植物常見病原菌。該菌可以產(chǎn)生纖維素酶，破壞植物細胞壁，引起西紅柿莖腐病[8]。在食用菌栽培中也是常見的污染菌。谷物中常見此菌，Lugauskas等報告表明在谷物收獲、存儲、打粉等整個加工過程中均有發(fā)現(xiàn)[9]。P.funiculosum可在木材、皮革制品上生長，對軍用篷布、槍套、背包甚至槍彈都有較嚴重的危害[10-11]。因此，是美國、中國軍用標準中霉菌檢驗的指示菌之一。如何防治包括P.funiculosum等霉菌對工農(nóng)業(yè)產(chǎn)品地侵染以及危害具有重要的意義。然而在防霉研究中，有關(guān)P.funiculosum的研究很少。本文采用目前公認對真菌抑制效果較好的檸檬醛作為材料，以P.funiculosum為對象，研究采用不同方式以及不同濃度的檸檬醛對P.funiculosum生長以及孢子萌發(fā)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

繩狀青霉（Penicillium funiculosum，AS 3.3875），購自中科院菌種保藏中心。檸檬醛（分析純），購自中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司

1.2 方法

1.2.1 檸檬醛對P.funiculosum生長的抑制作用檢測

P.funiculosum菌種活化后采用察氏培養(yǎng)基于28℃培養(yǎng)7 d。制備孢子懸浮液、計數(shù)，同時檢測孢子活力[11]。

采用兩種方法研究檸檬醛對P.funiculosum生長的抑制作用。

1.2.1.1 濾紙片法[12]

將已滅菌直徑為1.6 cm的濾紙片浸入2、3、4、5和6 mg·mL-15種濃度的檸檬醛溶液中，以50%甘油溶劑為對照，浸泡2 h后取出晾干。

取0.5 mL孢子懸浮液于裝有4.5 mL察氏上層培養(yǎng)基的試管中，使孢子終濃度為105個·mL-1。振蕩均勻，倒入準備好的察氏下層培養(yǎng)基平板上。冷卻后用無菌鑷子夾取濾紙片平放于平板上，用封口膠將平板密閉，于25℃培養(yǎng)，24 h后開始觀察霉菌生長情況，用游標卡尺采用十字交叉法量取各試驗組抑菌圈直徑。每個濃度處理設(shè)置3組重復(fù)。并按下列公式計算抑菌效果：

抑制率（%）＝（試驗組抑菌圈直徑－對照組抑菌圈直徑）/對照組抑菌圈直徑×100%

1.2.1.2 揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測法[13]

取P.funiculosum孢子懸液0.5 mL均勻涂布于直徑為9 cm的察氏培養(yǎng)基平板，25℃培養(yǎng)3 d。用滅菌打孔器打孔得到直徑為5 mm的菌栓。把菌栓（菌絲面向下）放入新鮮的察式平板中央，然后在培養(yǎng)皿蓋（中央）上放置直徑1.6 cm，在不同濃度檸檬醛溶液及50%甘油溶劑對照中浸泡2 h的濾紙片，用封口膜密封防止檸檬醛揮發(fā)，倒置培養(yǎng)25℃培養(yǎng)24～48 h，觀察菌落大小，量取直徑，記錄結(jié)果。

菌落增長率（%）＝（試驗組菌落直徑－0.5）/0.5×100%

抑制率（%）＝（對照組菌落直徑－試驗組菌落直徑）/對照組菌落直徑×100%

MIC[13-14]：找出菌落直徑未增加的平板，去掉封口膜，通風24 h除去檸檬醛后，25℃繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長情況。通風后菌落直徑開始增加的濃度為最小抑制濃度（MIC）。每個濃度處理設(shè)置3組重復(fù)。

1.2.2 檸檬醛處理不同時間對P.funiculosum孢子萌發(fā)的影響

在P.funiculosum孢子懸液中加入適量檸檬醛溶液，使檸檬醛終濃度為3.0 mg·mL-1，密閉，振蕩搖勻，室溫20℃下分別處理10、30、60、90、120 min后于 4℃，5 000 r·min-1離心 10 min，去上清液，再以無菌水離心洗滌2次，去除檸檬醛。以50%甘油為對照，每個時間處理設(shè)置3組重復(fù)。

處理后的孢子懸液1 mL加入裝有20 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，28℃，180 r·min-1振蕩培養(yǎng)，每2 h取樣，采用顯微鏡觀察孢子的萌發(fā)，并按下列公式計算其萌發(fā)率與抑制率：

孢子萌發(fā)率（%）＝萌發(fā)的孢子數(shù)/樣品孢子數(shù)×100%

1.3 統(tǒng)計方法

利用SPSS統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）檢驗差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檸檬醛對P.funiculosum抑制作用

采用濾紙片法以及揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測法對不同濃度檸檬醛抑制P.funiculosum作用結(jié)果見表1、2。

從表1中采用濾紙片法檢測結(jié)果可知，檸檬醛對P.funiculosum具有明顯的抑制作用。在較高濃度（6.0 mg·mL-1）下抑制作用明顯，抑菌圈直徑為2.33 cm，抑制率達到45.83%。而在低濃度條件下（3.0～5.0 mg·mL-1），抑菌圈直徑在1.65～1.93之間變化，且據(jù)其所得的抑制率為2.29%～20.42%。在此低濃度范圍內(nèi)，抑菌圈直徑與對照間無顯著性差異。根據(jù)試驗結(jié)果，將6.0 mg·mL-1作為檸檬醛對P.funiculosum的最小抑制濃度（MIC）。

揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測法對檸檬醛P.funiculosum生長抑制結(jié)果見表2。

表1 濾紙片法檢測不同濃度檸檬醛對P.funiculosum生長的抑制作用Table1 Effect of different concentration of citral on growth inhibition by filter paper method of P.funiculosum at 25℃

表2 揮發(fā)性物質(zhì)活性檢測法檢測不同濃度檸檬醛對P.funiculosum生長的抑制作用Table2 Effect of different concentration of citral on growth inhibition by volatile activity test method of P.funiculosum at 25℃

表2結(jié)果表明，不同濃度的檸檬醛揮發(fā)性成分對P.funiculosum生長具有不同程度的抑制作用。在較低濃度（2.0 mg·mL-1）條件下，P.funiculosum的菌落直徑為1.51 cm，明顯低于對照（1.82 cm），其增長率（202.67%）也比對照（262.67%）低。檸檬醛對其的抑制率為16.39%。隨著濃度增加，P.funiculosum的菌落直徑、菌落增長率以及檸檬醛對其的生長抑制率也隨之發(fā)生變化。在濃度為3.0 mg·mL-1時，菌落直徑為0.56 cm，相比對照與2.0 mg·mL-1條件下出現(xiàn)了明顯的下降，菌落增長率也由200%以上降低到38.0%。同時抑制率升高，達到61.87%。當濃度為4.0～6.0 mg·mL-1時，菌落基本無生長，直徑處于0.50～0.54之間，變化無顯著性差異。菌落增長率為0～8.67%，比對照（262.67%）降低約250%。生長抑制率處于69.98%～72.19%之間，相比對照表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

將濃度為 3.0、4.0、5.0、6.0 mg·mL-1的平板，去掉封口膜，通風24 h除去檸檬醛后，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，觀察菌落生長的結(jié)果表明檸檬醛揮發(fā)性成分對于P.funiculosum的最小抑制濃度（MIC）為3.0 mg·mL-1。

2.2 檸檬醛處理不同時間對P.funiculosum孢子萌發(fā)的影響

在檸檬醛抑制P.funiculosum孢子萌發(fā)試驗中，用3.0 mg·mL-1檸檬醛處理孢子不同時間觀察孢子萌發(fā)率，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，檸檬醛處理不同的時間長度，對P.funiculosum孢子的萌發(fā)時間以及萌發(fā)率都有明顯的影響。萌發(fā)時間方面，處理10 min，即對其萌發(fā)表現(xiàn)出抑制作用，萌發(fā)時間從14 h（對照）延至20 h，延遲了6 h。而處理120 min的樣品直到24 h開始才有極少量孢子開始萌發(fā)，比對照延遲了10 h。另外，處理30～90 min的樣品在萌發(fā)時間的延遲上與處理10 min的樣品一致，都延遲6 h后才開始萌發(fā)。

圖1 檸檬醛處理不同時間對P.funiculosum孢子萌發(fā)率的影響Fig.1 Effect of different treatment time of citral on percent inhibition of spore germination of P.funiculosum at 25℃

從萌發(fā)率來看，到24 h檸檬醛10 min處理組的萌發(fā)率為67.3%，比對照組（89%）降低了21.7%。30～90 min處理組的萌發(fā)率分別為60.3%、44.8%和23.5%。而120 min處理組的萌發(fā)率僅為5.2%，比對照降低了83.8%。并且隨著檸檬醛處理時間的延長，P.funiculosum孢子萌發(fā)率隨之下降。

3 討論與結(jié)論

檸檬醛是山蒼子精油中一種主要揮發(fā)性成分，具有廣譜的抗菌性。本文從濃度、作用方式與作用時間三個方面研究檸檬醛對P.funiculosum的抑制作用。以探索采用檸檬醛的運用方式和效果。

防霉劑的運用方法多種多樣，根據(jù)其種類特性不同可以采用直接與產(chǎn)品混合、表面噴涂、熏蒸和包埋緩釋等不同方式。濾紙片法是檢測各種直接接觸混合型防腐劑抑菌作用的常用方法。本文通過比較抑菌圈直徑的方法來比較不同濃度檸檬醛直接噴涂或者混合處理的方式對P.funiculosum的抑制作用。同時，基于檸檬醛的揮發(fā)性特點，采用揮發(fā)性活性物質(zhì)檢測法檢測不同濃度檸檬醛對P.funiculosum的抑制作用，以探索熏蒸和包埋緩釋的運用可能性與條件。

試驗結(jié)果表明，檸檬醛揮發(fā)性成分對P.funiculosum的MIC為3.0 mg·mL-1，而濾紙片法所得MIC為6.0 mg·mL-1。二者結(jié)果不一致，前者MIC低于后者。類似的結(jié)果在其他研究中也有報道[15]。另外，余伯良采用藥物平板法得到檸檬醛對A.flavus的最小抑制濃度（MIC）為 1.77 mg·mL-1[1]；張文平等采用藥敏板液體培養(yǎng)所得的結(jié)果為 2.590 μg·mL-1[17]；羅曼等的結(jié)果表明檸檬醛對A.flavus的MIC為0.5 μg·mL-1、最小致死濃度為 2.0 μg·mL-1[18]。這些結(jié)果上的區(qū)別，除了檢測方法本身的原因之外[15-16]，也從另一個角度表現(xiàn)出防霉劑使用劑量、方式對抑菌效果具有很大的影響。結(jié)合本文結(jié)果，相同低濃度下檸檬醛揮發(fā)性成分表現(xiàn)出比直接接觸更強的抑制作用。選擇采用低濃度熏蒸或包埋的方式，檸檬醛可能對P.funiculosum取得更好的抑制效果。

除了濃度與作用方式之外，作用時間也是防霉中的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)羅曼等的報道，檸檬醛在低濃度（0.5～2.0 μg·mL-1）條件下處理48 h，A.flavus孢子萌發(fā)率隨著濃度的增加而下降[18]。Sharma等采用其他植物精油對A.flavus孢子萌發(fā)抑制試驗也得到類似的結(jié)果[15]。本文通過檸檬醛不同時間處理P.funiculosum孢子萌發(fā)率的影響，探索檸檬醛抑菌的最佳作用時間與效果。在最小抑制濃度下，處理60 min即可達到超過50%的孢子萌發(fā)抑制率，同時延遲萌發(fā)6 h。而處理2 h后對孢子萌發(fā)起到極大的抑制作用，孢子萌發(fā)率僅5.2%，萌發(fā)時間延遲10 h。因此，采用熏蒸的方式，檸檬醛作用時間2 h以上即可對P.funiculosum起到較好的抑制效果。當然，在合適的濃度與作用時間之間的選擇并非完全不變，必須要根據(jù)實際作用方式與環(huán)境因素進行選擇。

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