麻類(lèi)韌皮纖維細(xì)胞骨架制備條件優(yōu)化研究

冷 超，王克臣，周亞?wèn)|，蘇 鈺，李 明*

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.哈爾濱學(xué)院，哈爾濱 150080）

細(xì)胞骨架（Cytoskeleton）是指真核細(xì)胞中的蛋白纖維網(wǎng)架體系。細(xì)胞骨架的概念有狹義和廣義之分。廣義的細(xì)胞骨架包括細(xì)胞核骨架、（核內(nèi)骨架及分裂期染色體骨架和核纖層）、細(xì)胞質(zhì)骨架、細(xì)胞膜骨架、細(xì)胞外基質(zhì)，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)上相互連接，形成貫穿于細(xì)胞的網(wǎng)架體系。狹義的細(xì)胞骨架僅指細(xì)胞質(zhì)骨架。在典型的高等真核細(xì)胞中，細(xì)胞骨架由三種不同類(lèi)型的纖維系統(tǒng)構(gòu)成：微管、中間纖維和微絲[1]。細(xì)胞骨架系統(tǒng)是當(dāng)前細(xì)胞生物學(xué)研究中最活躍的領(lǐng)域之一，近年來(lái)其研究方法多為應(yīng)用免疫熒光技術(shù)標(biāo)記細(xì)胞骨架系統(tǒng)[2-5]，而Pena發(fā)明的考馬斯亮藍(lán)染色法[6]，具有簡(jiǎn)單、方便、快速和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)[7]。本試驗(yàn)選擇考馬斯亮藍(lán)染色法，對(duì)1%Triton X-100抽提非骨架蛋白的時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，制備出了北方三種麻類(lèi)韌皮纖維細(xì)胞骨架（狹義），并進(jìn)行了初步觀察，一方面為其他麻類(lèi)纖維細(xì)胞骨架制備研究提供參考；另一方面為下一步采用免疫熒光法研究細(xì)胞壁加厚機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)選用了三種北方麻類(lèi)：亞麻，大麻和青麻，其中亞麻選擇了不同類(lèi)型的3個(gè)品種：RAISA（早熟高纖）、雙亞3號(hào)（晚熟高產(chǎn)）、VIMY（油用）。

1.2 方法

參照文獻(xiàn)[8]配制試劑。在亞麻、大麻和青麻開(kāi)花后期，選取生長(zhǎng)良好的代表性植株中部莖段（纖維細(xì)胞的次生壁開(kāi)始加厚），取新鮮的韌皮纖維細(xì)胞，立刻進(jìn)行下列操作：①取材：將上述材料放入盛有6 mmol·L-1PBS的小燒杯中，使其下沉，處理5～10 min；②抽提：吸去PBS，用1%Triton X-100處理20、25、30、40 min（37℃恒溫箱中）；③沖洗：吸去1%Triton X-100，M緩沖液充分洗3次，每次5 min；④固定：室溫3%戊二醛固定20 min；⑤ 沖洗：吸去固定液，6 mmol·L-1PBS洗3次，每次5 min，濾紙吸去殘液；⑥染色：0.2%考馬斯亮藍(lán)R250染色20 min；⑦制片：蒸餾水洗2～3次，將標(biāo)本置于載玻片上，加蓋玻片觀察。在Olympus光學(xué)顯微鏡下鏡檢，并在DCE-1數(shù)碼目鏡下照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 亞麻纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架

不同時(shí)間對(duì)細(xì)胞骨架圖像的影響很大，當(dāng)用1%Triton X-100抽提20 min時(shí)，RAISA的纖維細(xì)胞中仍有少量雜質(zhì)（見(jiàn)圖版Ⅰ-A），但是抽提40 min時(shí)，細(xì)胞中只有少量的骨架蛋白存在（見(jiàn)圖版Ⅰ-B），部分骨架也被Triton X-100抽提走。圖版Ⅰ-C、D均為1%Triton X-100抽提30 min，細(xì)胞骨架系統(tǒng)清晰可見(jiàn)，后者中可見(jiàn)2個(gè)細(xì)胞核和纖絲結(jié)構(gòu)。

其他2個(gè)亞麻品種雙亞3號(hào)和VIMY同樣是被1%Triton X-100抽提30 min效果最好，韌皮纖維細(xì)胞骨架系統(tǒng)清晰可見(jiàn)纖絲結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)也互相結(jié)合成網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖版Ⅱ-A、B）。由圖版Ⅱ-C可知，VIMY被1%Triton X-100抽提20 min時(shí)，細(xì)胞中的蛋白雜質(zhì)多，明顯看不出骨架；圖Ⅱ-D為抽提VIMY 40 min，觀察不到其細(xì)胞內(nèi)骨架。

圖版Ⅰ 亞麻RAISA韌皮纖維細(xì)胞骨架PlateⅠ Fibre cytoskeleton of flax varieties RAISA

圖版Ⅱ 亞麻雙亞3號(hào)、VIMY韌皮纖維細(xì)胞骨架PlateⅡ Bast fibre cytoskeleton of flax varieties Shuangya3 and VIMY

2.2 大麻與青麻纖維細(xì)胞的細(xì)胞骨架

試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)于開(kāi)花后期的大麻和青麻均為1%Triton X-100抽提30 min效果最好，圖版Ⅲ-A和Ⅲ-B表示不同放大倍數(shù)的大麻韌皮纖維細(xì)胞骨架，豐富的纖絲結(jié)構(gòu)清晰可見(jiàn)；圖Ⅲ-C為1%Triton X-100抽提非骨架蛋白30 min，高倍鏡下可見(jiàn)青麻韌皮纖維細(xì)胞骨架和圓形的細(xì)胞核，為了觀察其細(xì)胞核，且由于細(xì)胞是三維結(jié)構(gòu)，在顯微攝影時(shí)，位于非聚焦面上的纖絲結(jié)構(gòu)就不能被觀察到，從而圖版Ⅲ-C中纖絲結(jié)構(gòu)看起來(lái)不夠豐富。抽提40 min后的大麻韌皮纖維細(xì)胞骨架同樣有骨架蛋白被抽提，結(jié)構(gòu)不完整，而抽提40 min后的青麻韌皮纖維骨架蛋白被抽提，幾乎看不見(jiàn)細(xì)胞骨架（見(jiàn)圖版Ⅲ-D）。

圖版Ⅲ 大麻和青麻韌皮纖維細(xì)胞骨架PlateⅢ Fibre cytoskeleton of hemp and abutilon

3 討論與結(jié)論

細(xì)胞骨架發(fā)現(xiàn)較晚，主要是因?yàn)橐话汶婄R制樣采用低溫（0～4℃）固定，而細(xì)胞骨架會(huì)在低溫下解聚。直到1963年Slauterback改用戊二醛作固定劑，首次在水螅刺細(xì)胞中觀察到微管，此后研究者們便開(kāi)始了對(duì)細(xì)胞骨架的探索[9]。盡管目前對(duì)細(xì)胞骨架系統(tǒng)顯示的研究方法多集中在免疫熒光上，但是考馬斯亮藍(lán)染色法也不失為一種簡(jiǎn)單、方便、快速和經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)方法。

本研究表明，利用Triton X-100在37℃條件下，抽提開(kāi)花后期細(xì)胞次生壁加厚的麻類(lèi)韌皮纖維細(xì)胞骨架非蛋白時(shí)間為30 min較為合適。若時(shí)間稍短一點(diǎn)如20 min，在細(xì)胞中會(huì)有脂質(zhì)和蛋白質(zhì)抽提不完全；相反，抽提時(shí)間為40 min時(shí)就會(huì)有骨架蛋白被破壞，使得結(jié)構(gòu)不完整。有研究者對(duì)洋蔥細(xì)胞骨架制備中發(fā)現(xiàn)，1%Triton X-100抽提非骨架蛋白25 min觀察效果較好[10]，這可能是由于研究材料不同造成的（例如細(xì)胞壁厚度不同）。在試驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，因?yàn)槁轭?lèi)纖維細(xì)胞次生壁會(huì)不斷的加厚，所以如果取材的階段不同，那么纖維細(xì)胞壁厚度就會(huì)不同，最終就可能會(huì)影響到抽提時(shí)間的不一致。在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)到關(guān)于麻類(lèi)韌皮纖維細(xì)胞骨架的研究報(bào)道，在此情況下，采用考馬斯亮藍(lán)染色法可以快速的了解其細(xì)胞骨架系統(tǒng)，掌握對(duì)麻類(lèi)韌皮纖維細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)顯示方法。另外，動(dòng)力學(xué)可變性是細(xì)胞骨架的一個(gè)最大特征。即植物細(xì)胞在一定膨壓下擴(kuò)展或伸長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞壁就會(huì)按一定的方向和模式擴(kuò)張，此時(shí)已有的細(xì)胞壁構(gòu)架必須改變，以加入新的細(xì)胞壁原料。細(xì)胞骨架通過(guò)指導(dǎo)細(xì)胞壁原料的沉積在植物細(xì)胞的生長(zhǎng)控制和空間調(diào)整中發(fā)揮作用[11]。本試驗(yàn)應(yīng)用免疫熒光法研究纖維素微纖絲如何在細(xì)胞壁中沉積，即微絲和微管如何影響纖維細(xì)胞壁的加厚過(guò)程，為今后此方面的研究奠定基礎(chǔ)。

[1]趙大中,陳丹英,楊澄,等.植物中間纖維研究進(jìn)展[J].科學(xué)通報(bào),1997,44(14):1469-1474.

[2]王新字,王崇英,聶秀菀,等.洋蔥鱗莖表皮Actin細(xì)胞骨架的Rh-Ph熒光和光學(xué)顯微鏡觀察[J].西北植物學(xué)報(bào),1993,13(2):114-118.

[3]王曉華,姜奕,何安光.細(xì)胞骨架的熒光抗體染色方法研究[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),1994,23(5):439.

[4]叢斌,許萍,楊茂成,等.小麥根尖細(xì)胞分化過(guò)程中微絲骨架分布格局[J].復(fù)旦學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,1996,35(6):661-664.

[5]Ross J H E,Hutchings A,Butcher G W,et al.The intermediate filament-related system of higher plant cells shares an epitope with cytokeratin B[J].Cell Sci,1991,99:91-98.

[6]Pena S O J.A new technique for visualization of the cytoskeleton in cultured fibroblast with Commassie blue R250[J].Cell Biol Intern Reports,1980(4):149-153.

[7]黃祥輝.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)[M].北京:高等教育出版社,1986.

[8]章靜波,黃東陽(yáng),方瑾.細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2006:50-52.

[9]王馳,莊逢源,王文.空間生命科學(xué)中細(xì)胞骨架的研究進(jìn)展[J].醫(yī)用生物力學(xué),2007,22(2):216-219.

[10]馬云,王啟釗,王伍,等.洋蔥細(xì)胞骨架制備條件優(yōu)化及影響因素研究[J].新鄉(xiāng)學(xué)院學(xué)報(bào),2009,26(1):37-40.

[11]時(shí)蘭春,王益川,王伯初.植物細(xì)胞骨架與細(xì)胞生長(zhǎng)[J].植物生理學(xué)通訊,2007,43(6):1175-1181.