穿山龍總皂苷對(duì)CIA大鼠滑膜血管新生的作用*

董文娟，梁秀軍，翟澤玲，宋鴻儒

(承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid Arthritis,RA）是常見、多發(fā)的免疫性疾病，主要侵犯關(guān)節(jié)滑膜，表現(xiàn)為多發(fā)性、進(jìn)行性滑膜炎，病理特征為滑膜細(xì)胞增生、血管新生增多、血管翳形成等。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF）是促進(jìn)血管生成的特異性因子，與血管新生有關(guān)。穿山龍民間多用于治療風(fēng)濕病、冠心病、腰腿疼痛等癥[1]。本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)檢測(cè)膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collageninduced arthritis，CIA）大鼠滑膜組織MVD和VEGF的表達(dá)與變化情況，觀察穿山龍總皂苷對(duì)CIA大鼠滑膜血管新生的作用，并探討作用機(jī)理，為穿山龍治療RA提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性Wistar大鼠42只，實(shí)驗(yàn)起始體重(140±20）g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào):0158513。

1.2 主要試劑及設(shè)備 牛Ⅱ型膠原，美國(guó)Chondrex公司;弗氏完全佐劑(CFA），美國(guó)Sigma公司。山羊抗大鼠CD31多克隆抗體，美國(guó)Santa公司;兔抗大鼠VEGF多克隆抗體，美國(guó)Thermo公司;免疫組織化學(xué)試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。穿山龍總皂苷，承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所提取;雷公藤多甙片，黃石飛云制藥有限公司;薯蕷皂苷元，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司。

1.3 模型制備及模型成功的判斷標(biāo)準(zhǔn)[2-3]將溶于醋酸的牛Ⅱ型膠原(2mg/ml）與CFA等體積混合、乳化，制成Ⅱ型膠原乳劑。無(wú)菌條件下，在大鼠背部及尾根部多點(diǎn)注射(每只0.2ml），第7d相同劑量加強(qiáng)一次，作為激發(fā)注射。用關(guān)節(jié)炎指數(shù)(AI）作為判斷模型是否成功的標(biāo)準(zhǔn)。肢體關(guān)節(jié)腫脹按0-Ⅳ級(jí)評(píng)分:0，無(wú)紅腫;Ⅰ，趾關(guān)節(jié)稍腫;Ⅱ，趾關(guān)節(jié)及足趾關(guān)節(jié)腫脹;Ⅲ，踝關(guān)節(jié)以下足爪腫脹;Ⅳ，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部足爪腫脹。AI值=四肢肢體關(guān)節(jié)腫脹級(jí)評(píng)分之和(0級(jí)為0分，Ⅰ級(jí)為1分，Ⅱ級(jí)為2分，Ⅲ級(jí)為3分，Ⅳ級(jí)為分，總分為16分）。AI值≥4分為造模成功。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥 42只Wistar大鼠，隨機(jī)取6只做為正常對(duì)照組(A組），按1.3的方法注射等量生理鹽水;其余36只大鼠待成功建立CIA模型后隨機(jī)分組:CIA模型組(B組）、雷公藤組(C組）、穿山龍總皂苷高劑量組(D組）、穿山龍總皂苷中劑量組(E組）、穿山龍總皂苷低劑量組(F組）、薯蕷皂苷元組(G組），每組6只大鼠。致炎后第14d起，B組大鼠不再做任何處理，C組大鼠給予雷公藤多甙片(12mg/kg/d灌胃，D組、E組、F組大鼠分別給予不同劑量的穿山龍總皂苷(100、50、25mg/kg/d）灌胃，G 組大鼠給予薯蕷皂苷元(50mg/kg/d）灌胃，各組用藥時(shí)間均為2天。

1.5 大鼠一般狀態(tài)的觀察 于造模前后觀察大鼠的飲食、毛色，神志、活動(dòng)狀態(tài)及關(guān)節(jié)紅腫情況。

1.6 關(guān)節(jié)滑膜MVD及VEGF表達(dá)的檢測(cè) 灌胃治療21d后，各組大鼠斷頭處死，取雙側(cè)膝關(guān)節(jié)滑膜置于10%中性甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，片厚5μm。

1.6.1 檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜MVD:SP免疫組織化學(xué)染色法，山羊抗大鼠CD31多克隆抗體標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞(一抗稀釋濃度1:50），DAB顯色、蘇木素復(fù)染。每只大鼠選取6張切片，每張切片先在低倍鏡下找出三個(gè)血管密度最高的區(qū)域，然后在高倍鏡(400倍）下計(jì)數(shù)這三個(gè)區(qū)域的微血管數(shù)，取平均值[4]。

1.6.2 檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜VEGF的表達(dá):SABC免疫組織化學(xué)染色法，一抗稀釋濃度為1:50。VEGF定位于細(xì)胞漿，以細(xì)胞漿呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞。采用MiVnt圖像分析系統(tǒng)在400倍顯微鏡下對(duì)免疫組化陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行定量分析，以免疫陽(yáng)性產(chǎn)物面積占視野面積的比值作為VEGF蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。每只大鼠選取6張切片，每張切片觀察3個(gè)視野，取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s）表示，組間比較用方差分析，方差不齊用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般狀態(tài)及四肢關(guān)節(jié)局部病變情況 大鼠初次免疫注射后，背部及尾根部形成多處小潰瘍，被毛無(wú)光澤;第12d后，后足部出現(xiàn)明顯腫脹，發(fā)紅;以后逐漸累及后肢膝關(guān)節(jié)及前肢。A組大鼠在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間飲食正常，精神狀態(tài)好，被毛有光澤，四肢關(guān)節(jié)無(wú)明顯變化。B組大鼠進(jìn)食減少，精神萎靡，四肢關(guān)節(jié)持續(xù)腫脹，且足爪出現(xiàn)畸形，行動(dòng)不便。藥物治療后，C、D、E、F、G組大鼠與B組大鼠相比，上述癥狀均有不同程度減輕。

2.2 關(guān)節(jié)滑膜微血管MVD檢測(cè)結(jié)果 B組大鼠滑膜組織血管豐富，新生血管數(shù)量較多且密集，MVD明顯大于A組(P＜0.01）。與B組大鼠相比，各治療組大鼠的MVD明顯降低(P＜0.01）;各治療組間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05）。見附表。

附表 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜MVD和VEGF的表達(dá)(±s，n=6）

附表 各組大鼠關(guān)節(jié)滑膜MVD和VEGF的表達(dá)(±s，n=6）

與A組比較:▲P＜0.01，與B組比較:★P＜0.01

group MVD VEGF A 3.00±0.71 0.0014±0.0002 B 9.20±1.30▲ 0.1167±0.0207▲C 5.00±0.82▲★ 0.0420±0.0057▲★D 5.75±0.96▲★ 0.0351±0.0096▲★E 5.00±0.82▲★ 0.0321±0.0023▲★F 4.80±0.45▲★ 0.0452±0.0078▲★G 5.20±0.84▲★ 0.0397±0.0076▲★

2.3 關(guān)節(jié)滑膜VEGF的表達(dá) B組(模型組）大鼠關(guān)節(jié)滑膜VEGF的表達(dá)明顯高于A組(P＜0.01）。C、D、E、F、G組大鼠關(guān)節(jié)滑膜VEGF的表達(dá)明顯低于B組(P＜0.01）;各組治療組間比較無(wú)顯著性差異(P＞0.05）。見附表。

3 討論

研究表明，血管新生和血管翳形成在RA的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。隨著病情發(fā)展，血管增生、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)軟骨和骨組織侵蝕，破壞關(guān)節(jié)正常組織結(jié)構(gòu)。許多因子參與了RA血管新生的過(guò)程，VEGF是促進(jìn)血管生成的特異性因子。VEGF及其受體在血管新生中起著最關(guān)鍵的作用，可調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移、管腔形成等重要環(huán)節(jié)[5]。VEGF通過(guò)與其特異性受體Flt-1和KDR/Flk-1作用，促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂，從而促進(jìn)新生血管的形成。研究發(fā)現(xiàn)，關(guān)節(jié)組織VEGF及其受體Flt-1和KDR/Flk-1的表達(dá)強(qiáng)弱與關(guān)節(jié)炎的嚴(yán)重程度和血管新生關(guān)系密切，提示VEGF在CIA的發(fā)展中調(diào)控了血管的發(fā)生[6]。本研究亦發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠滑膜MVD和VEGF表達(dá)高于正常組，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

穿山龍是薯蕷科薯蕷屬植物穿龍薯蕷的根莖，有效成分主要為甾體皂苷類，有多種藥理作用，能祛風(fēng)除濕、舒筋活血、止咳化痰。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，穿山龍對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎具有治療作用，能緩解大鼠關(guān)節(jié)腫脹等炎癥反應(yīng)，減輕滑膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和滑膜組織增生等病理改變[7]。本研究進(jìn)一步觀察了穿山龍總皂苷對(duì)CIA大鼠滑膜血管新生和VEGF表達(dá)的影響。本研究發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各治療組大鼠滑膜MVD和VEGF水平明顯降低(P＜0.01），且各治療組間比較無(wú)顯著差異(P＞0.05）。本研究表明，穿山龍總皂苷可能通過(guò)抑制CIA大鼠滑膜VEGF的異常表達(dá)，減輕血管新生，減輕炎癥反應(yīng)，但穿山龍總皂苷中具體哪種成分對(duì)CIA起治療作用尚待進(jìn)一步研究。

[1]王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)[M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社，1999.427，817.

[2]朱蕾，魏偉.白芍總苷對(duì)大鼠膠原性關(guān)節(jié)炎及其免疫功能的影響[J].中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(20):1547-1551.

[3]Welles WL,Batlisto JR.Suppression of adjuvant arthritis by antibodies specific for collagen type Ⅱ[J].Immunol Commun,1981,10(8):673-685.

[4]張育，周瑋，顧健，等.沙利度胺及氨甲喋呤抗CIA大鼠滑膜血管新生及其作用機(jī)制的研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2008，12(5):23-27，32.

[5]Garrato A,Galleqo-plazas J,Guillen-ponce C.Anti-VEGF therapy:a new approach to colorectal cancer therapy[J].Expert Rev Anticancer Ther,2006,6(10):1385-1396.

[6]Lu J,Kobayashi K,Yoda Y,et al.Vascular endothelial growth factor expression and regulation of murinecollagen-induced arthritis[J].J Immunol,2000,164(11):5922-5927.

[7]謝守軍，宋鴻儒.穿山龍總皂苷對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].遼寧中醫(yī)雜志，2007，34(9):1323-1325.