NPPB基因SNP-c.-1298 G/T與漢族人群脈壓的相關(guān)性研究

李 貴，陳舒玲

（福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院心內(nèi)科心電圖室，福建 福州 350005）

原發(fā)性高血壓是多種心、腦血管疾病的重要病因和危險因素，影響重要臟器例如心、腦、腎的結(jié)構(gòu)和功能，最終導(dǎo)致這些器官的功能衰竭，迄今仍是心血管疾病死亡的主要原因之一。該病的發(fā)生主要與遺傳、飲食、精神應(yīng)激、體重等因素有關(guān)。當(dāng)前，我們對高血壓的診斷、治療、考核療效主要是以收縮壓（SBP）≥140 mmHg 和/或舒張壓 （DBP）≥90 mmHg為標(biāo)準(zhǔn)。近年來隨著高血壓治療中對SBP的重視和大動脈彈性功能研究的進(jìn)展，脈壓（PP）這一大動脈彈性指標(biāo)正在成為心血管病研究領(lǐng)域中的一個重要熱點。PP作為心腦血管病研究中的獨立危險因子，其預(yù)測價值大于SBP和DBP，尤其是在老年人群中，PP的大小可以預(yù)測動脈粥樣硬化所導(dǎo)致的心腦血管疾病的發(fā)生，現(xiàn)已被用作預(yù)測心腦血管疾病發(fā)生率與病死率的重要指標(biāo)之一［1-3］。

高血壓晚期主要會導(dǎo)致左心室肥大，進(jìn)而引起心力衰竭，近年來B型腦鈉肽（BNP）廣泛用于心力衰竭的診斷，且有重要診斷價值。心室肥大會引起充盈壓的升高，正常人BNP主要由左室心肌細(xì)胞合成分泌，其分泌量隨心室充盈壓的高低而變化。BNP的生理作用為擴(kuò)張血管，增加排鈉，對抗腎上腺素、腎素-血管緊張素等的水、鈉潴留效應(yīng)，因此高血壓時BNP水平升高，起到保護(hù)機(jī)體的作用。而BNP水平的高低主要是由編碼該多肽的NPPB基因決定的，因此本課題就NPPB基因與高血壓發(fā)病關(guān)聯(lián)作一研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

高血壓組：2007年10月-2008年3月我院門診及住院符合條件的高血壓患者共120例，其中男65 例，女 55 例，平均年齡（59.9±12.33）歲。 入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)2004年《中國高血壓防治指南》高血壓診斷標(biāo)準(zhǔn)：未治療前非同日3次測量取血壓平均值SBP≥140 mmHg，和（或）DBP≥90 mmHg 者。 或者既往有高血壓病史，正在用降壓藥治療者，雖血壓＜140/90 mmHg也可入選。排除標(biāo)準(zhǔn)：①繼發(fā)性高血壓；②嚴(yán)重貧血、甲亢、心臟瓣膜病、先天性心臟病、心肌病、動靜脈瘺、縮窄性心包炎、心包積液、嚴(yán)重的心律失常、周圍血管疾病、糖尿病、心肌梗死、充血性心力衰竭及患嚴(yán)重心腦腎疾病不能耐受檢查者。

正常對照組：同期我院健康體檢者共120例，其中男62例，女58例，平均年齡（58.7±12.7）歲。 入選標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)根據(jù)2004年 《中國高血壓防治指南》：SBP＜140 mmHg，DBP<90 mmHg 者， 常規(guī)化驗無異常，無各類心血管、腦血管、腎、內(nèi)分泌方面疾病。

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 應(yīng)用廈門泰京生物科技有限公司提供的DNA提取試劑盒從患者及健康對體檢查EDTA抗凝外周血中抽取DNA，-20℃保存?zhèn)溆?，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.2 PCR引物及PCR反應(yīng) 應(yīng)用Primer Express軟件對引物進(jìn)行設(shè)計。上游引物：5′aag gag gca ctg gga gag ggg aat 3′，下游引物：5′ccc cac caa gcc aac aca gga tgg a 3′（上海生工生物工程服務(wù)有限公司合成），引物擴(kuò)增的產(chǎn)物為NPPB基因轉(zhuǎn)錄起始點上游-1 299 bp至-895 bp之間的長度為429 bp的DNA序列。PCR反應(yīng)體系50 μL，含上下游引物各0.5 μL，緩沖液5 μL， 氯化鎂 4 μL， 模板 1 μL，dNTP 1 μL，Taq 酶 0.5 μL，加雙蒸水補(bǔ)足反應(yīng)體系。體系反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 1 min，52℃退火 30 s，72℃延伸1 min，共擴(kuò)增30個循環(huán)，最后72℃延伸2 min。

1.2.3 1.5%瓊脂糖凝膠電泳

1.2.4 測序 PCR產(chǎn)物直接測序由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司完成。

1.2.5 記錄一般資料 所有研究對象均測量血壓、身高、體重，檢測空腹甘油三脂、空腹膽固醇、空腹血糖、肌酐、尿酸、心率，了解吸煙史、飲酒史，高血壓病人還應(yīng)記錄服用降壓藥的情況及高血壓病史。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 一般臨床資料

結(jié)果見表1。高血壓組和正常對照組基本資料比較先行方差齊性檢驗（Levene法），方差齊采用t檢驗，方差不齊采用 t′檢驗。 結(jié)果顯示：PP、MAP、肌酐在兩組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義，其余差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 兩組中各項臨床指標(biāo)的差異性

結(jié)果見表2。在高血壓組和正常對照組中，不同PP水平年齡差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），平均年齡隨著PP水平的增高而增大，其他指標(biāo)分布在不同PP水平間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.3 NPPB基因測序圖

結(jié)果見圖1。

2.4 各基因型在高血壓組和正常對照組的例數(shù)分布情況

結(jié)果見表3。

表1 高血壓組和正常對照組一般臨床資料的比較 （±s）

表1 高血壓組和正常對照組一般臨床資料的比較 （±s）

注：與高血壓組比較，1）P＜0.05

性別（男/女）年齡（歲）BMI（kg/m2）TG(mmol/L)CHOL（mmol/L）GLU（mmol/L）URIC（μmol/L）Cr（μmol/L）MAP（mmHg）PP（mmHg）心率（次/min）高血壓組 65/55 69.9±12.33 24.4±2.77 1.61±0.86 5.04±0.94 5.14±0.84 348.4±91.43 82.9±22.29 106.6±11.55 54.7±14.42 74.6±7.68正常對照組 62/58 69.7±12.70 24.1±2.64 1.57±0.99 4.99±0.85 5.10±0.50 340.8±81.84 76.2±16.141） 89.4±9.971） 43.4±11.731） 75.3±8.90

表2 在高血壓組、正常對照組中各項臨床指標(biāo)的差異性 （±s）

表2 在高血壓組、正常對照組中各項臨床指標(biāo)的差異性 （±s）

注：兩組中同-PP 水平比較，1）P＜0.05

組別 PP（mmHg）年齡 人數(shù) BMI（kg/m2）TG（mmol/L）CHOL（mmol/L）GLU（mmol/L）URIC（μmol/L）Cr（μmol/L）心率（次/min）高血壓組<40 58.6±12.43 12 24.6±2.87 1.65±0.93 5.05±0.87 5.08±0.73 374.5±85.34 83.5±22.0 74.99±6.86 40～59 59.8±12.17 61 24.5±2.80 1.62±0.88 5.08±0.92 5.11±0.82 347.0±91.40 81.8±22.81 74.8±7.88≥60 63.0±12.23 47 24.3±2.70 1.63±0.81 5.12±1.00 5.22±0.81 350.5±93.19 84.2±21.65 74.2±7.62正常對照組<40 56.6±11.92 17 24.25±2.57 1.65±0.89 4.91±0.89 5.14±0.48 333.76±81.43 76.05±17.32 75.90±9.23 40～59 59.7±12.27 63 24.36±2.69 1.59±1.05 5.10±0.46 5.10±0.85 343.23±81.90 76.32±15.84 75.12±9.04≥60 71.6±10.651） 40 23.63±2.63 1.63±1.06 5.16±0.66 5.20±0.81 354.64±81.92 76.87±13.01 73.93±6.47

圖1 NPPB基因5′側(cè)翼區(qū)測序圖

表3 各基因型在高血壓組和正常對照組的例數(shù)分布情況 ［例（%）］

由表3可以看出，在120例高血壓患者中，G純合子70.8%，G/T雜合子26.7%，T純合子2.5%。三種基因型分布頻率與預(yù)計值差異無統(tǒng)計學(xué)意義，符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律（P>0.05）。說明樣本來自一個較大的、處于隨機(jī)婚配狀態(tài)的群體，具有一定的代表性。

2.5 高血壓組和正常對照組等位基因頻率分布

結(jié)果見表4。

表4 高血壓組和正常對照組等位基因頻率分布 ［例（%）］

高血壓組中，G等位基因頻率高于對照組，T等位基因頻率低于正常對照組，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這尚不能說明G等位基因可能是原發(fā)性高血壓的危險性基因，而T等位基因可能是原發(fā)性高血壓的保護(hù)性基因。由此，我們進(jìn)一步對高血壓組和正常對照組基因型分布做統(tǒng)計分析，我們將GT基因型和TT基因型做一個合并，高血壓組按是否攜帶有T等位基因分為GG基因型組和GT+TT基因組，正常對照組也依此劃分，再進(jìn)行卡方檢驗，結(jié)果見表5。

表5 高血壓組和正常對照組基因型分布頻數(shù) （例）

2.6 高血壓組內(nèi)各基因型的臨床指標(biāo)比較

結(jié)果見表 6。 BMI、TG、CHOL、URIC、Cr、MAP、PP、HR各項指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

2.7 正常對照組各基因型臨床指標(biāo)比較

結(jié)果見表 7。 BMI、TG、CHOL、URIC、Cr、MAP、HR各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PP在正常對照組中GG基因型顯著高于GT+TT基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 討 論

近年來，隨著高血壓治療中對SBP的重視和大動脈彈性功能研究的進(jìn)展，PP這一大動脈彈性指標(biāo)正成為心腦血管病研究領(lǐng)域的一個重要熱點。國內(nèi)有研究報道，北京城市與農(nóng)村自然人群高血壓普查資料（n=29 707例，35歲～74歲），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PP增寬是動脈硬化及CVD高危的一個標(biāo)志。在調(diào)整了性別、年齡、心血管病史、吸煙等因素后，PP與CVD發(fā)病仍成顯著正相關(guān)，尤其是在60歲以上的老年患者更是如此。

影響PP的因素很多，但關(guān)于基因與PP關(guān)系的研究，目前國內(nèi)外還比較少。國外研究顯示血管緊張素Ⅱ1型受體 （AT1）基因、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因能影響年齡與PP之間的關(guān)系，從而可能增加潛在的心血管風(fēng)險性。研究報道，ACE基因多態(tài)性能獨立地影響年齡與PP之間的關(guān)系，從而調(diào)節(jié)心血管風(fēng)險性。說明在基因、機(jī)械因素和心血管病風(fēng)險之間存在著新的復(fù)雜的相互作用。

表6 高血壓組各基因型臨床指標(biāo)比較

表7 正常對照組各基因型臨床指標(biāo)比較

近年來人們陸續(xù)在高血壓人群中發(fā)現(xiàn)多種形式的NPPB基因以及利鈉肽系統(tǒng)其他基因的突變和多態(tài)性。國外有研究報道證實原發(fā)性高血壓患者血漿BNP水平顯著高于對照組。血漿BNP水平隨年齡增加而增加，女性高于男性。有報道提到日本人群中血漿BNP水平與年齡、尿鈉排泄、更高的血壓水平相關(guān)。在社區(qū)樣本中，人們發(fā)現(xiàn)，更高的血漿BNP水平會增加男性血壓升高的風(fēng)險，在女性則沒有這種關(guān)聯(lián)。研究證實NPPB基因5′端側(cè)翼區(qū)的一個VNTR多態(tài)性位點與日本女性原發(fā)性高血壓相關(guān)。NPPB基因或是其上游調(diào)控序列發(fā)生突變，可能會引起基礎(chǔ)BNP水平的改變，進(jìn)而影響到血壓水平。因此，NPPB基因被認(rèn)為是高血壓病的一個候選基因。NPPB基因5′端側(cè)翼區(qū)的rs375381多態(tài)性位點位于NPPB基因轉(zhuǎn)錄起始點上游1 191個堿基處。其上游是TC富集區(qū)，其下游是Alu序列，這兩個區(qū)域都屬于NPPB基因的調(diào)控區(qū)。因此這一位點的多態(tài)性可能與人群中高血壓發(fā)病率相關(guān)。

本研究中NPPB基因5′端側(cè)翼區(qū)的rs375381多態(tài)性位點高血壓的關(guān)系。高血壓組與正常組比較，血Cr、MAP、PP較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；余各項指標(biāo)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。在高血壓組和血壓正常組中，不同PP組年齡有差異（P<0.05），平均年齡隨著PP組的增大而增大。這與之前報道的高血壓臨床研究的結(jié)果是相符合的。NPPB基因的c.-1298 G/T多態(tài)性位點，其基因型頻率目前在漢族人群中尚未見報道。本研究首次報道了漢族人群中NPPB基因c.-1298 G/T多態(tài)性位點在高血壓人群和正常對照人群中的基因分布情況。在高血壓組和正常對照組中均按基因型進(jìn)行分組，觀察PP、MAP等各項臨床指標(biāo)在各基因型中的差異是否有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果發(fā)現(xiàn)高血壓組和正常對照組基因型頻率和等位基因頻率分布的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。PP在正常對照組中GG基因型要高于GT+TT基因型，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；其余各項指標(biāo)在正常對照組內(nèi)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

高血壓是一個多基因病，是遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。當(dāng)遺傳和環(huán)境因素作用累積到一定程度，最終導(dǎo)致基因表達(dá)異常及病理性血壓升高。多數(shù)情況下是多個基因表達(dá)異常共同導(dǎo)致血壓升高。一個基因表達(dá)異常，可能有其他基因的代償作用參與其中。因而僅從高血壓發(fā)病率，或者是MAP、PP這樣一些宏觀的指標(biāo)上，尚不能很客觀地反映出這一個基因的表達(dá)異常。

其次，雖然腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）是動脈血壓的主要調(diào)節(jié)因素，而BNP可以對抗腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAAS）的縮血管作用，同ANP一起組成人體抵御容量負(fù)荷過重及高血壓的一個主要內(nèi)分泌系統(tǒng)。NPPB基因是血漿BNP水平個體差異的決定因素且被認(rèn)為是高血壓的候選基因，但是與NPPB基因相關(guān)的多態(tài)性位點目前已發(fā)現(xiàn)的有23個，我們觀察的對象只是這些多態(tài)性位點中位于5′轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)的一個，其余的位點的情況如何，其他多態(tài)性位點之間有無相互作用，作用的程度強(qiáng)弱，哪些位點對于NPPB基因的表達(dá)起了主要的作用，哪些起了次要的作用，各自貢獻(xiàn)程度的大小，都是值得深入探討的問題。

現(xiàn)在遺傳學(xué)在原發(fā)性高血壓病、糖尿病等多基因病的研究上已經(jīng)提出了微效多基因（minor gene）的概念：基因數(shù)量多，每個基因?qū)Ρ硇偷挠绊戄^微，所以不能把它們個別的作用區(qū)別開來，稱這類基因為微效基因。而且，對于基因多態(tài)性的研究，已經(jīng)有學(xué)者采用連鎖不平衡分析的方法。一次對同一人群同一基因的多個SNP位點進(jìn)行分析，得出人群中多個SNP位點的排列組合情況以及主要排列組合在人群中的分布頻率，在此基礎(chǔ)上引入了單倍型的概念，進(jìn)而研究這些排列組合與疾病或某些指標(biāo)的關(guān)系。

BNP具有利尿、利鈉、擴(kuò)血管及抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)活性等作用，能抑制促腎上腺皮質(zhì)激素的釋放及交感神經(jīng)的過度反應(yīng)，減少內(nèi)皮損傷的作用也減小或消失，因而BNP基因異常較正常人更容易發(fā)生高血壓病。

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