膀胱移行細(xì)胞癌組織中p53、VEGF、PCNA的表達(dá)及臨床意義

李俊鵬 于 滿 王志勇 常 輝 王振潮

1 承德醫(yī)學(xué)院 (2007級(jí)碩士研究生）（067000）

2 承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院泌尿外科（067000）

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤、其具有高復(fù)發(fā)、多發(fā)性的生物學(xué)特點(diǎn)。其發(fā)生始終貫穿著一系列分子事件的變化，可能與癌基因的激活和抗癌基因的失活或變異，漸進(jìn)性細(xì)胞間期控制機(jī)制的破壞，血管生成等多因素密切相關(guān)。據(jù)此我們應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP方法，檢測(cè)p53、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、增殖細(xì)胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）3種腫瘤標(biāo)志物在膀胱移行細(xì)胞癌中的表達(dá)，以探討這3種標(biāo)志物與膀胱移行細(xì)胞癌的病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)聯(lián)性及相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院2005至2006年手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的膀胱移行細(xì)胞癌組織石蠟標(biāo)本43例，其中男30例，女13例，年齡33～87歲，平均年齡65歲。病理分級(jí)按WHO標(biāo)準(zhǔn)，G1級(jí)12例，G2級(jí)24例，G3級(jí)7例。臨床分期按TNM標(biāo)準(zhǔn)，分為淺表型（Tis～T1）34例，浸潤(rùn)型（T2～T4）9例。另取10例正常膀胱黏膜（取自因前列腺增生癥行開放手術(shù)的患者）作為對(duì)照組。

1.2 試劑

鼠抗人p53單克隆抗體、鼠抗人VEGF單克隆抗體、鼠抗人PCNA單克隆抗體、SP試劑盒均購(gòu)自北京中山生物技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

將蠟塊標(biāo)本均行4μm連續(xù)切片4張，均經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化，以過氧化氫阻斷內(nèi)源性酶并行抗原熱修復(fù)。1張切片行常規(guī)HE染色，供組織學(xué)觀察并進(jìn)行病理分型和診斷。另3張切片嚴(yán)格按照試劑配套說(shuō)明書中SP法工作流程操作。每次試驗(yàn)均以PBS代替一抗的方法設(shè)置陰性對(duì)照，并以已知陽(yáng)性切片作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.4 結(jié)果判定

p53、PCNA為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，VEGF為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性染色。選擇典型部位，隨意取5個(gè)高倍視野（10×40），計(jì)數(shù)1000個(gè)細(xì)胞，p53、VEGF根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例分為以下三級(jí)，（—）陽(yáng)性細(xì)胞比例＜10%；（＋）陽(yáng)性細(xì)胞比例10%～30%；（＋＋）陽(yáng)性細(xì)胞比例＞30%。PCNA也根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞比例分為以下三級(jí)，（—）陽(yáng)性細(xì)胞比例＜10%；（＋）陽(yáng)性細(xì)胞比例10%～25%；（＋＋）陽(yáng)性細(xì)胞比例＞25%。其中（—）為該標(biāo)本目標(biāo)分子陰性表達(dá)，而后二者均為目標(biāo)分子陽(yáng)性表達(dá)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS11.5軟件包，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，相關(guān)分析采用spearman等級(jí)相關(guān)分析。

表1 p53、VEGF、PCNA在正常膀胱組織與膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)情況

表2 p53、VEGF、PCNA表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床特征之間的關(guān)系

表3 p53、VEGF、PCNA表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床特征之間的相關(guān)性

2 結(jié) 果

2.1 p53、PCNA為細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，VEGF為細(xì)胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕黃色或棕色顆粒為陽(yáng)性染色。正常膀胱組織與膀胱移行細(xì)胞癌組織中3種蛋白的表達(dá)（表1）。正常膀胱組織中無(wú)p53、VEGF、PCNA陽(yáng)性表達(dá)。膀胱移行細(xì)胞癌組織中p53陽(yáng)性表達(dá)率為48.84%；VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為67.44%；PCNA陽(yáng)性表達(dá)率為62.79%。3種蛋白在正常膀胱組織與膀胱移行細(xì)胞癌組織中表達(dá)有顯著差異（P＜0.05）。

2.2 3種蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)、臨床分期的關(guān)系

p53在G1、G2、G3級(jí)膀胱移行細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為12.67%、54.17%、85.71%，G1與G2、G3級(jí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G2與G3級(jí)比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。p53在Tis～T1與T2～T4期膀胱移行細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為38.24%、88.89%，Tis～T1與 T2～T4期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。VEGF在G1、G2、G3級(jí)膀胱移行細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為33.33%、75.00%、100%，G1與G2、G3級(jí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G2與G3級(jí)比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。VEGF在Tis～T1與T2～T4期膀胱移行細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.82%、100%，Tis～T1與T2～T4期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PCNA在G1、G2、G3級(jí)膀胱移行細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為25.00%、79.17%、100%，G1與G2、G3級(jí)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），G2與G3級(jí)比較無(wú)顯著差異（P＞0.05）。PCNA 在 Tis～T1與T2～T4期膀胱移行細(xì)胞癌組織中陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.82%、100%，Tis～T1與T2～T4期比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

2.3 3種蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)、臨床分期的相關(guān)性

3種蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)呈正相關(guān)（rp53=0.409、rVEGF=0.467、rPCNA=0.481，P均＜0.05）。p53、VEGF蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期呈正相關(guān)（rp53=0.455、rVEGF=0.304，P均＜0.05）。PCNA蛋白表達(dá)與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期無(wú)相關(guān)性。

3 討 論

3.1 p53在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)的意義

p53在1989年被霍普金斯大學(xué)的Bert Vogelstein等真正明確為抑癌基因，其分為野生型與突變性，野生型p53基因是細(xì)胞周期的重要調(diào)節(jié)基因，它的失活對(duì)腫瘤的形成起重要作用[1]。閻洪濤等[2]研究表明，p53與膀胱移行細(xì)胞癌組織學(xué)分級(jí)、臨床分期和預(yù)后密切相關(guān)。本組研究結(jié)果表明，p53在正常膀胱黏膜中無(wú)表達(dá)，在膀胱移行細(xì)胞癌組織中明顯表達(dá)。p53陽(yáng)性率隨膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)增高而增高，隨臨床分期增加而增高，且p53與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)、臨床分期呈正相關(guān)。其可以作為判斷膀胱移行細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。

3.2 VEGF在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)的意義

VEGF最早于1989年發(fā)現(xiàn)[3]，可在很多正常成人和動(dòng)物組織中表達(dá)，但一般水平較低，在視網(wǎng)膜病變和腫瘤等病理情況下其表達(dá)異常升高。膀胱癌是一種血管豐富的實(shí)體腫瘤，在膀胱癌整個(gè)發(fā)生、發(fā)展過程中血管生成幾乎貫穿于始終。郭雪濤等[4]研究表明，VEGF的表達(dá)率隨腫瘤分期、分級(jí)的升高而明顯增高。本組研究結(jié)果表明，VEGF在正常膀胱黏膜中無(wú)表達(dá)，在膀胱移行細(xì)胞癌組織中明顯表達(dá)。VEGF陽(yáng)性率也隨膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)增高而增高，隨臨床分期增加而增高，且VEGF與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)、臨床分期也呈正相關(guān)。因此其也可以作為判斷膀胱移行細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后的重要指標(biāo)。

3.3 PCNA在膀胱移行細(xì)胞癌中表達(dá)的意義

PCNA是由Miyachi等[5]1978年發(fā)現(xiàn)的一種相對(duì)分子質(zhì)量為36×103的組蛋白，是DNA復(fù)制合成必不可少的物質(zhì)，直接參與DNA的合成。其在靜止期細(xì)胞中的量很少，于細(xì)胞周期G1期開始合成，在S期達(dá)高峰，于G2、M期明顯下降，對(duì)DNA復(fù)制的調(diào)節(jié)起重要作用。PCNA的合成和表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)密切相關(guān)，是反映細(xì)胞增殖的主要生物學(xué)指標(biāo)。盧童等[7]研究表明，PCNA與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)呈正相關(guān)，與臨床分期無(wú)相關(guān)性。本組研究結(jié)果表明，PCNA在正常膀胱黏膜中無(wú)表達(dá)，在膀胱移行細(xì)胞癌組織中明顯表達(dá)。PCNA陽(yáng)性率也隨膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)增高而增高，隨臨床分期增加而增高，且PCNA與膀胱移行細(xì)胞癌病理分級(jí)呈正相關(guān)，但PCNA與膀胱移行細(xì)胞癌臨床分期無(wú)相關(guān)性。因此其可以作為判斷膀胱移行細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后的輔助指標(biāo)。

綜上所述，采用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)p53、VEGF、PCNA在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)，對(duì)于判斷膀胱移行細(xì)胞癌惡性程度和預(yù)后有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。

[1] Lane DP. P53 guanlian of the genoma [J].Nature,1992,358(6381)：15-16.

[2] 閻洪濤,龔百生,廖勇,等.膀胱移行細(xì)胞癌組織中P53和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)的關(guān)系及臨床意義[J].中華泌尿外科雜志,2006,27(3)：178-180.

[3] Ferrara N,Henzel WJ. Pituitary follicular cells secrete a novel heparin-binding. Growth factor. Specifi c for vascular endothelial cells [J]. Biochem Biophys Res Commun,1989,161(2)：851-858.

[4] 郭雪濤,崔明玉.P53、P16、TGF-α、EGFR、VEGF在膀胱移行細(xì)胞癌組織中的表達(dá)及意義[J].現(xiàn)代泌尿外科雜志,2007,14(4)：225-228.

[5] Miyachi K,Frilzler MJ,Tan EM,et al. Autoantibody to a nuclear antigen in proliferating cells [J].J Immunol,1978,121(6)：2228-2234.

[6] 盧童,楊為民,章群. 膀胱移行細(xì)胞癌組織中P16、P53和PCNA的表達(dá)及其意義[J].臨床泌尿外科雜志,2008,23(1)：58-60.