SAHA與順鉑聯(lián)用對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞生長抑制作用的研究

申俊 顧亞軍# 柏景坪

1.杭州口腔醫(yī)院黏膜科，#頜面外科，浙江 杭州 310006；2.首都醫(yī)科大學(xué)黏膜科，北京 100069

以順鉑為代表的鉑類化合物由于其顯著的抗瘤效應(yīng)，是治療口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）最常用的一類化療藥物。為克服臨床上越來越多的患者對(duì)順鉑產(chǎn)生的耐藥性及減輕由于用藥劑量所導(dǎo)致的不良反應(yīng)，以順鉑為核心的聯(lián)合用藥方案成為目前口腔腫瘤防治領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)［1-2］。辛二酰苯胺異羥肟酸（suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA ）是目前最具有代表性的組蛋白去乙?；敢种苿┲唬鳛橐活愋屡d的抗腫瘤藥物，具有低毒高效的特點(diǎn)［3］。同時(shí)，許多研究發(fā)現(xiàn)SAHA除自身具有抗瘤活性外，還與一些傳統(tǒng)的化療藥物展現(xiàn)出良好的協(xié)同治療效果［4］。因此本研究嘗試將SAHA與順鉑聯(lián)用，初步探討兩者聯(lián)合治療口腔鱗癌治療的可能性。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株 口腔鱗癌細(xì)胞株Tca8113及KB購自四川大學(xué)衛(wèi)生部移植工程和移植免疫重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 藥物及試劑 SAHA購自Alexis公司，用DMSO配置成10 mmol/L儲(chǔ)存液，-20 ℃保存。順鉑購自遼寧錦泰藥業(yè)公司，用生理鹽水配置成1 mg/mL儲(chǔ)存液，-4 ℃保存。MTS試劑購自Promega公司。抗乙?；M蛋白H3抗體購自Upstate公司。

1.3 藥物處理 分別以不同濃度的SAHA（0.5、1、2、4、8、10 μmol/L）及順鉑（2、4、6、8、10 μg/mL）分別處理Tca8113及KB細(xì)胞，作用24 h后，換用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行MTS檢測。其后，根據(jù)細(xì)胞對(duì)單獨(dú)使用這2種藥物的劑量反應(yīng)，選擇將低劑量的2種藥物進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，SAHA（2 μmol/L）與順鉑（4 μg/mL）先后或同時(shí)處理細(xì)胞4 h后，換用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，進(jìn)行細(xì)胞毒性（MTS及克隆形成實(shí)驗(yàn)）檢測。

1.4 組蛋白的提取及其乙?；降臋z測經(jīng)藥物處理后，以組蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取核內(nèi)組蛋白，用Western blot法分別檢測2種口腔鱗癌細(xì)胞在經(jīng)過SAHA處理前后其組蛋白乙?；降淖兓?，以未經(jīng)過藥物處理的細(xì)胞作為空白對(duì)照，曝光顯色后用凝膠成像掃描分析儀掃描蛋白條帶。等量提取的組蛋白條帶通過考馬斯蘭亮染色顯示于12%的SDS-PAGE膠上。

1.5 細(xì)胞毒性檢測（MTS法） 收集生長良好的Tca8113及KB細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，以1×104個(gè)/孔接種于96孔板，待其融合度達(dá)到60%左右加入不同濃度的藥物，每組每濃度設(shè)立3個(gè)平行孔，調(diào)節(jié)每孔液體量為100 μL。藥物處理結(jié)束后，每孔加入MTS 20 μL，37 ℃，CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的環(huán)境下溫育1 h，測590 nm波長的吸光度（A），細(xì)胞存活率=A藥物組平均/A對(duì)照組平均×100%。

1.6 細(xì)胞毒性檢測（克隆形成實(shí)驗(yàn)） 收集生長良好的Tca8113及KB細(xì)胞，制成單細(xì)胞懸液后調(diào)節(jié)細(xì)胞密度，以3×102個(gè)/板的密度接種于平板之中（平板直徑為60 mm）。待細(xì)胞生長穩(wěn)定后，加入藥物進(jìn)行處理。在藥物處理結(jié)束后，換用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞5～7 d，純甲醇固定細(xì)胞，以Giemsa染色計(jì)數(shù)細(xì)胞集落，集落形成率=集落形成數(shù)目/接種細(xì)胞數(shù)×100%。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 所得數(shù)據(jù)均用SPSS 11.0軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組均數(shù)的比較采用單因素方差分析及兩兩比較法，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 2種口腔鱗癌細(xì)胞都對(duì)SAHA及順鉑呈現(xiàn)出較好的敏感性 單獨(dú)使用SAHA或順鉑處理細(xì)胞，2種口腔鱗癌細(xì)胞都呈現(xiàn)出較好的劑量與效應(yīng)關(guān)系。由于目前尚未有SAHA單獨(dú)作用于口腔鱗癌細(xì)胞的有關(guān)報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)中，在進(jìn)行藥物的聯(lián)合應(yīng)用前，我們首先檢測了該藥物單獨(dú)使用對(duì)細(xì)胞的毒性作用。結(jié)果顯示，隨著用藥劑量的增加，特別在4 μmol/L濃度之上，隨SAHA濃度的加大，2種細(xì)胞的生長相應(yīng)都受到了顯著的抑制，說明口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)SAHA具有敏感性（圖1）。此外，我們還觀察了單獨(dú)使用順鉑對(duì)2株口腔鱗癌細(xì)胞生長增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)中所使用的2種細(xì)胞都對(duì)順鉑具有較好的敏感性，藥物毒性作用的增強(qiáng)與使用的藥物劑量的增加相一致（圖2）。

圖1 不同劑量的SAHA單獨(dú)作用于口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)其生長增殖的影響Fig.1 The effect of various concentrations of SAHA on the proliferation ability of OSCC cell lines

2.2 經(jīng)由SAHA處理后，2種細(xì)胞內(nèi)組蛋白乙?；乃窖杆偬岣?本實(shí)驗(yàn)中，我們嘗試采用低劑量的SAHA處理細(xì)胞4 h，然后提取細(xì)胞核內(nèi)的組蛋白，檢測其乙?；谋磉_(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與未加藥物處理的對(duì)照組相比，低劑量的SAHA短時(shí)間內(nèi)即可導(dǎo)致組蛋白乙?；斤@著提高，順鉑的同時(shí)加入，對(duì)該組蛋白乙?；轿串a(chǎn)生明顯的影響（圖3）。

圖2 不同劑量的順鉑單獨(dú)作用于口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)其生長增殖的影響Fig.2 The effect of various concentrations of Cisplatin on the proliferation ability of OSCC cell lines

2.3 低劑量的SAHA和順鉑聯(lián)合應(yīng)用能顯著增強(qiáng)對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的毒性作用 在進(jìn)一步有關(guān)聯(lián)合用藥的研究中，我們選擇了低劑量的SAHA（2 μmol/L）及順鉑（4 μg/mL）聯(lián)合使用來處理細(xì)胞。MTS結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Tca8113細(xì)胞各組間及KB細(xì)胞各組間差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=136.254，P＜0.01；F=134.794，P＜0.01）。2 μmol/L的SAHA處理口腔鱗癌細(xì)胞4 h時(shí)，對(duì)大部分細(xì)胞的生長增殖未產(chǎn)生明顯的影響（圖4）；與之相對(duì)照，再聯(lián)合了低劑量的順鉑以后，藥物的細(xì)胞毒性得到了顯著增強(qiáng)，大部分細(xì)胞生長受到了抑制（圖4），不同細(xì)胞2個(gè)聯(lián)合用藥組分別與單獨(dú)使用順鉑組比較，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。不同細(xì)胞2個(gè)聯(lián)合用藥組分別與單獨(dú)使用SAHA組相比較，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在聯(lián)合用藥中，我們還嘗試了不同的用藥方式，即先后和同時(shí)給藥。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這2種用藥方式都具有較好的協(xié)同作用（圖4），2種用藥方式相比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。為進(jìn)一步驗(yàn)證聯(lián)合2種藥物的使用對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的毒性作用，我們還同時(shí)應(yīng)用了克隆形成實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Tca8113細(xì)胞各組間及KB細(xì)胞各組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=124.377，P＜0.01；F=123.296，P＜0.01）。當(dāng)2種低劑量的藥物聯(lián)合應(yīng)用后，細(xì)胞所形成的集落數(shù)明顯減少，不同細(xì)胞聯(lián)合用藥組集落形成率與單獨(dú)使用順鉑組相比較，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），不同細(xì)胞聯(lián)合用藥組與單獨(dú)使用SAHA組相比較，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01） （表1）。

圖3 Western blot檢測細(xì)胞核內(nèi)組蛋白乙?；降淖兓疐ig.3 Examination of acetylated histone after drug treatment by Western blot

圖4 單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用低劑量的SAHA和順鉑對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的毒性比較Fig.4 The comparison of cytotoxicity in OSCC cell lines of either treatment of subtoxic SAHA and Cisplatin alone,or the combinative treatment of both drugs

表1 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測SAHA和順鉑單獨(dú)或聯(lián)合處理細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞遠(yuǎn)期增殖影響Tab.1 Long-time OSCC cancer cell survival examined by colony formation assay

3 討 論

順鉑作為美國FDA 批準(zhǔn)上市的第一個(gè)鉑配合物抗癌藥，由于其良好的抗癌效應(yīng)和經(jīng)濟(jì)效應(yīng)，目前已成為臨床上治療口腔鱗癌最常用的藥物之一。該藥物可以通過與DNA形成交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA的復(fù)制過程，發(fā)揮細(xì)胞毒性作用。但是，隨著順鉑在臨床上的廣泛應(yīng)用，一方面，越來越多的患者對(duì)順鉑出現(xiàn)了耐藥現(xiàn)象，另一方面，在以順鉑為核心的聯(lián)合化療方案中，由其用藥劑量所導(dǎo)致的不良反應(yīng)仍然不可避免［1］。這兩方面的突出問題嚴(yán)重限制了該類藥物的使用，同時(shí)也促使學(xué)者不斷地尋找新的低毒高效的化療方案。SAHA是最具代表性的組蛋白去乙?；敢种苿┲唬擃愃幬锏难邪l(fā)是基于有關(guān)組蛋白乙?；漠惓顟B(tài)與染色質(zhì)重塑與腫瘤關(guān)系的研究。SAHA能通過組蛋白的乙?；谷旧|(zhì)重塑為促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的疏松結(jié)構(gòu)，重新激活腫瘤細(xì)胞中由于異常的組蛋白去乙?；磉_(dá)受阻的基因，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡［3］。雖然順鉑和SAHA作用的靶向不同，由于在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中，DNA和染色質(zhì)的變化往往作為一個(gè)整體緊密聯(lián)系在一起，提示我們：順鉑和SAHA的聯(lián)用有可能通過DNA和染色質(zhì)的橋梁作用發(fā)揮更強(qiáng)的抗瘤效果。因此在本實(shí)驗(yàn)中，我們選擇在口腔鱗癌的治療領(lǐng)域?qū)AHA與低劑量順鉑進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，以期達(dá)到減毒增效的目的。

本實(shí)驗(yàn)在聯(lián)合用藥的劑量上，最終只選擇了低劑量SAHA與順鉑進(jìn)行配伍組合，這是基于2個(gè)方面的考慮：一方面，單獨(dú)使用順鉑對(duì)2種口腔鱗癌細(xì)胞都具有很好的敏感性，因此，在尚未建立對(duì)順鉑耐藥的口腔鱗癌細(xì)胞株的情況下，為了盡量減少這種配伍組合的毒副作用，我們僅選擇了低劑量順鉑進(jìn)行聯(lián)用，同時(shí)，SAHA作為一類新的抗腫瘤藥物，與傳統(tǒng)的化療藥物相比，目前價(jià)格仍較為昂貴，從經(jīng)濟(jì)的角度出發(fā)，在保證減毒增效的前提下，我們也希望能盡量采用低劑量的SAHA來發(fā)揮增效的作用；另一方面，我們對(duì)SAHA處理后細(xì)胞組蛋白內(nèi)的乙酰化水平進(jìn)行了檢測，證實(shí)了低劑量的SAHA即可迅速導(dǎo)致組蛋白乙?；降脑龈?。組蛋白乙?；乃脚c染色質(zhì)的重塑存在著直接的關(guān)系，高乙?；慕M蛋白通過瓦解氨基酸末端的二級(jí)機(jī)構(gòu)并中和組蛋白所帶的正電荷，以及疏水的乙?；鶊F(tuán)產(chǎn)生的空間阻力，可降低組蛋白與DNA的親和力，使核小體松解，染色質(zhì)變得疏松［3］。國外有學(xué)者曾報(bào)道，低劑量的SAHA處理細(xì)胞4 h以內(nèi)就能夠引起組蛋白的乙?；降奶岣?，導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)型的松散，但同時(shí)不伴有基因組的不穩(wěn)定或凋亡的誘導(dǎo)現(xiàn)象［5］，我們在口腔鱗癌細(xì)胞中首次證實(shí)了該結(jié)論。綜合考慮上述2方面的原因，我們嘗試了低劑量的SAHA與順鉑聯(lián)合用藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)亞毒劑量的SAHA與順鉑進(jìn)行聯(lián)合應(yīng)用，在抑制腫瘤細(xì)胞生長方面能取得顯著的協(xié)同作用。我們推測其原因可能是由于：低劑量的SAHA短時(shí)間內(nèi)雖然不能導(dǎo)致明顯的殺細(xì)胞作用，但是可迅速引起組蛋白乙酰化水平提高，使染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)變得疏松，后者可導(dǎo)致染色質(zhì)上的DNA得到充分的暴露，有效促進(jìn)順鉑與DNA的交聯(lián)作用，從而增強(qiáng)順鉑的殺傷細(xì)胞作用。

本研究同時(shí)選擇采用MTS法及克隆形成實(shí)驗(yàn)對(duì)聯(lián)合用藥的細(xì)胞毒性進(jìn)行檢測。相對(duì)于其他檢測方法，克隆形成實(shí)驗(yàn)所耗費(fèi)的周期較長，但是由于克隆形成實(shí)驗(yàn)直接反應(yīng)了腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)期增殖能力，彌補(bǔ)了MTS等即時(shí)檢驗(yàn)的不足［6］，因此我們同時(shí)采用了克隆形成實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證MTS檢測結(jié)果。上述2種檢測方法互為補(bǔ)充，也使我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果更具有說服力。

綜上，通過初步的體外實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)SAHA能增加口腔鱗癌細(xì)胞對(duì)傳統(tǒng)化療藥物順鉑的敏感性，值得我們進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

［1］ Caponigro F, Rosati G, De Rosa P, et al.Cisplatin, raltitrexed,levofolinic acid and 5-fluorouracil in locally advanced or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck： a phase Ⅱ randomized study ［J］.Oncology, 2002, 63(3)：232-238.

［2］ Gedlicka C, Formanek M, Selzer E, et al.Phase Ⅱ study with docetaxel and Cisplatin in the treatment of recurrent and/or metastatic squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Oncology, 2002, 63(2)： 145-150.

［3］ Kelly WK, Marks PA.Drug insight： Histone deacetylase inhibitors-development of the new targeted anticancer agent suberoylanilide hydroxamic acid ［J］.Nat Clin Pract Oncol,2005, 2(3)：150-157.

［4］ Whang YM, Choi EJ, Seo JH, et al.Hyperacetylation enhances the growth-inhibitory effect of all-trans retinoic acid by the restoration of retinoic acid receptor beta expression in head and neck squamous carcinoma (HNSCC) cells ［J］.Cancer Chemother Pharmacol, 2005, 56(5)： 543-555.

［5］ Zhu WG, Lakshmanan RR, Beal MD, et al.DNA methyltransferase inhibition enhances apoptosis induced by histone deacetylase inhibitors ［J］.Cancer Res, 2001,61(4)：1327-1333.

［6］ Franken NA, Rodemond HM, Stap J, et al.Clonogenic assay of cells in vitro ［J］.Nat Protoc, 2006, 1(5)： 2315-2319.