HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞增殖及凋亡的影響

顧紅軍 董宇超 李強(qiáng)

1.解放軍第一00醫(yī)院急診科，江蘇 蘇州 215007；2.第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院呼吸內(nèi)科，上海 200433

組蛋白乙?；癄顟B(tài)由組蛋白乙酰化酶（histone acetyltransferases，HATs）和組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）調(diào)節(jié)。HDACs在染色質(zhì)重塑、基因阻遏及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分化中起到重要的作用［1］。腫瘤細(xì)胞中HDACs功能異?？蓪?dǎo)致許多基因轉(zhuǎn)錄受抑制，從而抑制抑癌基因的表達(dá)。HDACs作用下組蛋白去乙?；瘜?dǎo)致了染色體的空間結(jié)構(gòu)緊密，抑制了基因的表達(dá)［2］。HDACs抑制劑（HDACs inhibitor，HDACi）在多項(xiàng)研究中表明對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡作用。而HDACi對(duì)HDACⅠ型和Ⅱ型均有抑制作用［3］，非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株中尚未明確HDACs中HDAC1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。我們通過HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株A549，觀察HDACs中HDAC1對(duì)肺腺癌細(xì)胞增殖、周期和凋亡的影響，以進(jìn)一步明確HDAC1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 乙?；M蛋白H4（Ac-H4）小鼠抗人單克隆抗體、HDAC1小鼠抗人單克隆抗體和 β-actin單克隆抗體為美國(guó)Santa cruz生物技術(shù)公司產(chǎn)品。PCR 引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，HDAC1（mRNA序列號(hào)：NM_004964）：上游5’-GCCATCCTGGAACTGCTAAA-3’，下游5’-GGCTTGAAAATGGCCTCATA-3’，GAPDH：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游：5’-ATGGTGGTGAAGACGCCAGT-3’。氯化丙啶（PI，美國(guó)Sigma公司），Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物技術(shù)公司。Real-time PCR Master Mix為日本TAKARA生物有限公司產(chǎn)品。HDAC1 siRNA購自美國(guó)Ambion公司，INTERFERinTM transfection Kit 購自Polyplus-transfection公司，Opti-DMED購自美國(guó)Gibco BRL公司。HDAC1 siRNA和Negative siRNA由美國(guó)QIGEN公司設(shè)計(jì)和合成。HDAC1 siRNA序列：正義鏈，5’-GCCGGUCAUGUCCAAAGUATT-3’；反義鏈，5’-UACUUUGGACAUGACCGGCTT-3’，同時(shí)設(shè)計(jì)了與其組成相同但堿基序列不同的Negative control作為陰性對(duì)照。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件 肺腺癌A549細(xì)胞株由中國(guó)科學(xué)院上海生物細(xì)胞研究所提供，在含10%小牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的飽和濕度條件下生長(zhǎng)傳代，實(shí)驗(yàn)時(shí)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞（表1）。

1.2.2 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)分組：陰性對(duì)照組（Negative siRNA組，簡(jiǎn)稱Negcontrol）、HDAC1 siRNA20 nmol/L組（簡(jiǎn)稱siHDAC1）和空白對(duì)照組（簡(jiǎn)稱Blankcontrol）。siRNA轉(zhuǎn)染前24 h A549細(xì)胞鋪板，按一定的細(xì)胞數(shù)將A549細(xì)胞分別接種于96孔板、24孔板或6孔板。轉(zhuǎn)染當(dāng)天取適量siRNA與無血清培養(yǎng)基混合，用終濃度為20 nmol/L的HDAC1 siRNA輕混勻，室溫放置5 min。取相應(yīng)INTERFERinTM轉(zhuǎn)染劑與無血清培養(yǎng)基混合，輕混勻，室溫放置10 s。將上述兩者混勻，室溫放置10 min。更換培養(yǎng)液，將轉(zhuǎn)染復(fù)合物加到培養(yǎng)板或培養(yǎng)瓶中，輕柔搖勻，培養(yǎng)24 h后吸出培養(yǎng)基，加入含小牛血清的PRMI 1640培養(yǎng)液。在24 h收取細(xì)胞提取mRNA，48 h提取蛋白，每24 h換液1次，按對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞周期、凋亡或細(xì)胞增殖檢測(cè)。

表1 siRNA（20 nmol/L）轉(zhuǎn)染試劑劑量比例表Tab.1 siRNA (20 nmol/L) transfection reagent dose-rate

1.2.3 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 及Real-time PCR siRNA轉(zhuǎn)染24 h后分別收集細(xì)胞，TRIzol（美國(guó)Invitrogen公司）法抽提總mRNA。Realtime PCR法檢測(cè)HDAC1 mRNA表達(dá)，與內(nèi)參照GAPDH比較。PCR儀為7500型（美國(guó)Applied Biosystems公司）。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃變性15 s，60 ℃擴(kuò)增15 s，72 ℃延伸45 s，共40個(gè)循環(huán)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（RQ）=2-ΔΔCT，以對(duì)照組RQ值的均數(shù)為1，計(jì)算其他各組mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.2.4 Western blot法檢測(cè) siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞36 h后分別收集細(xì)胞，抽提總蛋白；經(jīng)BCA法行蛋白定量后，取30 μg蛋白行SDS-PAGE電泳分離，之后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉1 h后，分別以Ac-H4單抗（1∶500）或 HDAC1抗體（1∶500）4 ℃溫育過夜，TBS洗膜后，以HRP羊抗小鼠二抗（1∶2 000）室溫輕搖2 h后，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.5 MTT法檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞增殖抑制率的影響 A549細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株12、24和48 h，每孔加入5 mg/mL的MTT溶液10 μL，再培養(yǎng)4 h后，吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)液，加100 μL/孔DMSO，酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm 波長(zhǎng)處吸光度（A492），以空白對(duì)照調(diào)零。腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)存活率（%）=實(shí)驗(yàn)組A492/空白對(duì)照組A492×100%。

1.2.6 細(xì)胞周期測(cè)定 A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后收集細(xì)胞，每孔加入預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2次，加入預(yù)冷70%乙醇固定，4 ℃過夜。加入100 μg/mL的RNase 10 μL/孔， 50 μg/mL的碘化丙啶緩沖液300 μL/孔，4 ℃避光30 min，流式細(xì)胞儀（FACSCalibur，美國(guó)Becton Dickinson公司）檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.7 細(xì)胞凋亡測(cè)定 A549細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。siRNA轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，收集各組細(xì)胞，按照Annexin V細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說明測(cè)定細(xì)胞凋亡。

2 結(jié) 果

2.1 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞株對(duì)HDAC1 mRNA表達(dá)的影響 每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔，用Real-time PCR檢測(cè)siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞HDAC1 mRNA相對(duì)表達(dá)的變化，通過運(yùn)算得到兩組的RQ值。單因素方差分析，發(fā)現(xiàn)HDAC1 siRNA組轉(zhuǎn)染后HDAC1 mRNA表達(dá)水平為（0.23±0.05），低于Blank-control組的（1.0±0.03）和Neg-control組的（1.02±0.03）（P＜0.001），而兩個(gè)對(duì)照組間相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.42）。

2.2 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株對(duì)HDAC1蛋白和Ac-H4蛋白表達(dá)的影響HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，Western blot結(jié)果顯示HDAC1 siRNA組HDAC1蛋白的表達(dá)明顯低于陰性和空白對(duì)照組，而Ac-H4在HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后表達(dá)增加（圖1）。

2.3 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)腺癌細(xì)胞株生長(zhǎng)的抑制作用 以MTT法檢測(cè)A549轉(zhuǎn)染HDAC1 siRNA 6、12、24和48 h后與陰性對(duì)照組細(xì)胞抑制率。結(jié)果顯示：HDAC1 siRNA 轉(zhuǎn)染后，時(shí)間依賴性抑制A549細(xì)胞生長(zhǎng)，在12 h時(shí)即與陰性對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

圖1 Western blot檢測(cè)HDAC1蛋白和Ac-H4蛋白的表達(dá)Fig.1 Expression of HDAC1 and Ac-H4 detected by Western blot

表2 HDAC1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞各組細(xì)胞存活率Tab.2 Time-effect of HDAC1 siRNA on A549 cell proliferation(%, n=6, ±s)

表2 HDAC1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞各組細(xì)胞存活率Tab.2 Time-effect of HDAC1 siRNA on A549 cell proliferation(%, n=6, ±s)

Compared with Neg-control group, *: P＜0.05; ▲: P＜0.001.

Group t/h 6 12 48 72 Neg-contol 99.6±5.2 102.3±4.8 104.8±8.5 97.2±10.7 si HDAC1 95.2±4.3 83.6±5.3* 62.5±7.5▲ 53.4±5.7▲

2.4 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)A549細(xì)胞對(duì)細(xì)胞周期影響 結(jié)果顯示，A549細(xì)胞予以HDAC1 siRNA 轉(zhuǎn)染48 h后，可見HDAC1 siRNA組G2/M期細(xì)胞百分率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.015），S期明顯增高（P=0.04），G0/G1期減低（P=0.02）?？瞻缀完幮詫?duì)照組間細(xì)胞周期差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)A549細(xì)胞各組細(xì)胞周期影響Tab.3 Detection of the percentage of different phase cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group after 48 h(%, n=3,±s)

表3 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染48 h后對(duì)A549細(xì)胞各組細(xì)胞周期影響Tab.3 Detection of the percentage of different phase cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group after 48 h(%, n=3,±s)

Compared with Blank-control group, *: P＜0.05.

Group G0/G1 phase G2/Mphase S phase Blank-control 64.6±4.8 4.7±0.8 30.7±2.8 Neg-control 67.0±4.9 5.3±2.3 27.7±4.7 siHDAC1 41.0±3.8* 12.1±1.7* 46.9±3.1*

2.5 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染對(duì)肺腺癌細(xì)胞各組細(xì)胞凋亡率變化 檢測(cè)細(xì)胞凋亡統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HDAC1 siRNA 轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞48 h后細(xì)胞早期凋亡增加（P＜0.001），晚期凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。空白和陰性對(duì)照組間細(xì)胞凋亡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表4）。

表4 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率變化Tab.4 Detection of the percentage of apoptosis cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group(%, n=3, ±s)

表4 HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡率變化Tab.4 Detection of the percentage of apoptosis cells with HDAC1 siRNA on A549 cell in three group(%, n=3, ±s)

Compared with Blank-control group, *: P＜0.001.

Group Early phase apoptosis Late phase apoptosis Blank-control 5.01±0.41 4.93±0.87 Neg-control 5.22±0.58 5.42±1.84 siHDAC1 13.45±0.66* 5.71±1.65

3 討 論

HDACs屬于HDACs超家族，是一類具有能通過組蛋白轉(zhuǎn)錄后修飾來調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的酶［4］，共有Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四型。Ⅰ型HDACs包括HDAC1、2、3、8，與酵母菌的RPD3同源。Ⅱ型HDACs包括HDAC4、5、6、7、9、10，與酵母菌的HDA1同源。第Ⅲ型是酵母SIRT2類似蛋白，具有尼克酰胺腺苷酸的蛋白活性，但對(duì)于HDAC1的抑制劑不敏感；Ⅳ型HDACs是HDAC11。HDACs在染色質(zhì)重塑、基因阻遏、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和分化中起到重要的作用［1］。腫瘤細(xì)胞中HDACs功能異?？蓪?dǎo)致許多基因轉(zhuǎn)錄抑制，抑制抑癌基因的表達(dá)。HDACs可被募集結(jié)合在特定的啟動(dòng)子區(qū)，從而導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄抑制，腫瘤細(xì)胞可以通過此機(jī)制而存活。

HDACi抑制劑已被廣泛應(yīng)用于研究在體外腫瘤細(xì)胞和動(dòng)物模型中腫瘤發(fā)展等相關(guān)基因去抑制的效果。HDACi在多項(xiàng)研究中表明對(duì)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用［5-7］。HDACi的效果更多依賴于腫瘤細(xì)胞的類別而不是所選抑制劑的類型［8］。而HDACi對(duì)HDACⅠ型和Ⅱ型均有抑制作用［3］，尚未明確HDAC1在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。本實(shí)驗(yàn)用RNAi技術(shù)，沉默肺腺癌A549細(xì)胞HDAC1，觀察細(xì)胞增殖、凋亡和周期，進(jìn)一步明確了HDACs中HDAC1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中的作用。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR和Western blot技術(shù)分別檢測(cè)到HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后HDAC1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的表達(dá)都明顯受到抑制，說明HDAC1 RNA干擾有效。MTT法定量檢測(cè)，HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549后，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受抑制。流式細(xì)胞儀定量分析HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞較多積聚在G2/M期，細(xì)胞早期凋亡增加，和一定濃度下對(duì)HDACs多個(gè)靶點(diǎn)有作用的曲古霉素A干預(yù)得到相似的抑制腫瘤增殖效應(yīng)［9］。提示HDAC1在A549細(xì)胞株增殖中起著重要的作用。真核生物染色體的基本單位是核小體，核小體的核心是由4種組蛋白（H2A、H2B、H3和H4）各2個(gè)分子構(gòu)成八聚體，DNA的146個(gè)堿基對(duì)在每個(gè)組蛋白八聚體分子的表面盤繞構(gòu)成核小體。證實(shí)HDAC1基因沉默可能與組蛋白乙?；恢拢緦?shí)驗(yàn)予以HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染A549后，用Western blot技術(shù)發(fā)現(xiàn)乙?；M蛋白H4蛋白表達(dá)明顯增高。HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染腺癌細(xì)胞株，降低了HDAC1的表達(dá)，減少了組蛋白的去乙酰化，組蛋白H4的乙酰化增加，有利于抑癌基因的表達(dá)，使腫瘤細(xì)胞停滯在G2/M，凋亡細(xì)胞增多，是減少細(xì)胞增殖的原因。

HDAC1和HDAC2常形成異二聚體并參與組成許多蛋白復(fù)合體，如Sin3、NuRD和CoREST等［10］。許多涉及細(xì)胞周期調(diào)節(jié)、分化和發(fā)展的轉(zhuǎn)錄因子與HDAC1、HDAC2或HDAC1/HDAC2復(fù)合體有直接聯(lián)系。siRNA轉(zhuǎn)染試驗(yàn)證實(shí)了許多Ⅰ類HDACs成員在共抑制復(fù)合體控制的許多過程中起到重要作用。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用siRNA去除HDAC1引起細(xì)胞增殖減少，凋亡增多可能是因?yàn)镠DAC1 RNAi先使HDAC1 mRNA表達(dá)減少，從而影響該蛋白表達(dá)量，進(jìn)而影響HDAC1參與組成的許多組分復(fù)合體的完整性和功能，從而影響肺腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡。

HDACs的強(qiáng)效抑制劑曲古霉素A可抑制細(xì)胞增殖。用正常大鼠成纖維細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)：曲古霉素A可將增殖細(xì)胞特異地鎖定在G1和G2期，可見G1和G2期的演進(jìn)需要HDACs［11］。曲古霉素A去除后，鎖定在G1期的細(xì)胞同步進(jìn)入S期，而鎖定在G2期的細(xì)胞不能進(jìn)入M期，而是再次進(jìn)入S期，形成增殖性四倍體細(xì)胞。我們觀察到HDAC1低表達(dá)后A549細(xì)胞出現(xiàn)了G2/M期阻滯。由于G2/M期的細(xì)胞對(duì)于化療和放療都很敏感，因此設(shè)法使細(xì)胞停滯在G2期會(huì)提高腫瘤細(xì)胞對(duì)治療的敏感性。HDAC1 siRNA轉(zhuǎn)染引起的細(xì)胞周期鎖定可能是由于其造成的組蛋白高乙酰化狀態(tài)干預(yù)了細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子（如周期蛋白）的作用，不但可以抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，還可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)于化療和放療的敏感性。

綜上所述，我們認(rèn)為HDAC1 siRNA 轉(zhuǎn)染有效地抑制了肺腺癌細(xì)胞株中A549的HDAC1基因mRNA及蛋白的表達(dá)，增加了A549細(xì)胞中組蛋白H4的乙?；籋DAC1 siRNA在體外能通過G2/M細(xì)胞周期阻滯有效抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖，并可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)HDAC1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中起著重要的作用，為基因治療肺腺癌奠定了基礎(chǔ)。HDAC1在腫瘤細(xì)胞增殖中的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。要明確HDACS中HDAC1在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)中是否起主要作用，可設(shè)計(jì)對(duì)不同HDACs的siRNA相應(yīng)沉默其HDAC，更能準(zhǔn)確說明之間的差異。

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