Ikaros抑制垂體瘤生長(zhǎng)激素基因表達(dá)的機(jī)制

于順江 陳力 陳怡東 王京

北京世紀(jì)壇醫(yī)院(暨北京大學(xué)第九臨床醫(yī)學(xué)院)腫瘤放療科，*病理科，北京 100038

垂體瘤是一種常見(jiàn)的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤。其中，功能性垂體腺瘤約占70%，臨床表現(xiàn)為垂體生長(zhǎng)激素（growth hormone，GH）、泌乳素（prolactin，PRL）以及促腎上腺皮質(zhì)激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）等激素過(guò)度分泌所導(dǎo)致的多種內(nèi)分泌失調(diào)如身體發(fā)育異常、不孕不育及嚴(yán)重心血管疾病等。目前垂體瘤的發(fā)生機(jī)制仍不清楚。在垂體組織中，已鑒別出幾個(gè)公認(rèn)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白在激素分泌調(diào)節(jié)過(guò)程中起至關(guān)重要的作用［1-2］。本研究旨在探討Ikaros（Ik-1）調(diào)節(jié)GH分泌的作用機(jī)制，為功能性垂體腺瘤今后的臨床靶向治療提供重要的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 鼠垂體GH4細(xì)胞株購(gòu)于美國(guó)ATCC生物制品公司（Manassas，VA）。GH4細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素，2 mmol/L 谷氨酰胺和含10%胎牛血清的DMEM（Life Technologies）培養(yǎng)液中，在37 ℃、CO2體積分?jǐn)?shù)為5%的培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，常規(guī)8～10代傳代培養(yǎng)后細(xì)胞處于良好的指數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)，然后接種于直徑100 mm培養(yǎng)皿中貼壁生長(zhǎng)，取指數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ik-1或其蛋白同型Ik-6的細(xì)胞克隆株以G418進(jìn)行維持培養(yǎng)。

1.2 總RNA提取和Northern blot分析 用TRIzol kit（Life Technologies）提取GH4細(xì)胞總RNA，提取步驟參照廠家產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)，總RNA提取后測(cè)定濃度并儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩＿M(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，每個(gè)樣本取2.5 μg RNA裝載于1%甲醛-瓊脂糖膠中進(jìn)行電泳，電泳完成后將RNA轉(zhuǎn)移至尼龍膜，以32P-dCTP （Roche Diagnostics標(biāo)記盒） 隨機(jī)標(biāo)記的探針（鼠GH的cDNA片段長(zhǎng)為706 bp）進(jìn)行雜交，以3-磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（687 bp）cDNA標(biāo)記的探針作為內(nèi)對(duì)照。

1.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）分析 以冷PBS 1×沖洗GH4細(xì)胞2次，然后向細(xì)胞中加入溶解液（5%N P-4 0、1%SDS、20 mmol/L Tris.Cl、1 mmol/L DTT、1 mm ol/L E DTA、100 m mo l/L NaCl、1 mmol/L PMSF、10 mmol/L NaF、0.1 mmol/L Na Orth和5 μg/mL Aprotinin）冰上溶解5 min，采用室內(nèi)臺(tái)式離心機(jī)（半徑100 mm）以1 500 r/min離心10 min后留上清液，用Bio-Rad法測(cè)定蛋白濃度，將蛋白置于-70 ℃?zhèn)溆?。進(jìn)行Western blot實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別取50 μg蛋白先沸水煮沸5 min，然后將各樣本裝載于12% SDS-PAGE膠中進(jìn)行電泳，電泳完畢后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（Millipore），以5%脫脂牛奶封閉，以抗rGH（1∶50 000）抗體進(jìn)行孵化，置于4 ℃搖動(dòng)過(guò)夜。次日以0.05%PBS-Tween-20常溫洗膜10 min×3次，然后加入二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記，羊抗鼠，1∶2 000）室溫?fù)u動(dòng)1 h，以ECL化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行底物反應(yīng)和膠片曝光，以?-Actin抗體（1∶1 000） 對(duì)裝載的樣品量進(jìn)行校正（內(nèi)對(duì)照）。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 Ik-1和Ik-6表達(dá)質(zhì)粒及其空白對(duì)照質(zhì)粒PcDNA3.1由美國(guó)哈佛大學(xué)皮膚生物學(xué)研究中心的Dr.K.Georgopoulos教授惠贈(zèng)［1］。含有全部7個(gè)外顯子（Exon 1～7）的人全長(zhǎng)Ik-1基因cDNA（1 570 bp，Ik-1）以及剔除外顯子Exon 3～6的人Ik-1基因cDNA（truncated isoform， 902 bp，Ik-6）分別被克隆至pcDNA3.1載體上。值得一提的是，Ik-6蛋白功能上不具有與靶基因DNA結(jié)合的能力。Pit-1全長(zhǎng)cDNA的表達(dá)載體及其空白對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3.1由加拿大多倫多大學(xué)總醫(yī)院Dr.H.Elsholtz教授惠贈(zèng)。上述所有表達(dá)載體的目的基因核酸序列和方向均經(jīng)限切酶和DNA測(cè)序證實(shí)。轉(zhuǎn)染前，均以QiaGen Maxi-Prep試劑盒提取DNA，并進(jìn)行純化。以Lipofectamine法對(duì)GH4細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，以G418進(jìn)行穩(wěn)定克隆篩選。GH啟動(dòng)子活動(dòng)則由含有鼠的320 bp GH近端啟動(dòng)子片段的pSV2A-rGH-luc 測(cè)定。轉(zhuǎn)染細(xì)胞前，利用TRANSFAC Version 4.0數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)GH基因啟動(dòng)子DNA序列進(jìn)行分析。采用Lipofactamine法進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行熒光素酶（Luciferase）發(fā)光實(shí)驗(yàn)。為了校正轉(zhuǎn)染效率偏差，每次以20 ng/孔的pSV-半乳糖苷對(duì)照質(zhì)粒對(duì)轉(zhuǎn)染進(jìn)行校正。細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染48 h后，以裂解液（25 mmol/L glycylglycine、15 mmol/L MgSO4、4 mmol/L EGTA、1% Triton X、1 mmol/L DTT）溶解細(xì)胞，以熒光素酶發(fā)光檢測(cè)儀對(duì)Luciferase活動(dòng)進(jìn)行20～30 s讀數(shù)。為了觀察Ik-1對(duì)染色質(zhì)去乙酰化作用的影響，以Trichostatin-A（200 ng/mL）處理細(xì)胞16 h，然后評(píng)價(jià)Ik-1對(duì)GH啟動(dòng)子活動(dòng)的影響，每個(gè)試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.5 免疫組化分析 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ik-1、Ik-6或其空白對(duì)照質(zhì)粒的GH4細(xì)胞經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后，將細(xì)胞（1×106個(gè)）注入SCID鼠的腹部皮下，觀察其生長(zhǎng)。2周后，處死小鼠取生長(zhǎng)的瘤組織進(jìn)行免疫組化分析。標(biāo)本用4%的甲醛固定、石蠟包埋，切成6 μm厚后每片滴加100 μL的一抗，4 ℃過(guò)夜，加100 μL聚合物增強(qiáng)劑，室溫溫育20 min，PBS沖洗3次，每次3 min，然后滴加200 μL酶標(biāo)抗兔復(fù)合物，室溫溫育30 min，PBS沖洗3次，滴加DAB顯色液顯微鏡下觀察。

1.6 染色質(zhì)組蛋白免疫共沉淀試驗(yàn)（ChIP assay） 以5’-端的rGH啟動(dòng)子（距轉(zhuǎn)錄初始位320 bp的DNA序列片段）構(gòu)建成pSV2A-rGH-luc報(bào)告質(zhì)粒，然后在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ik-1或Ik-6的GH4細(xì)胞中進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。根據(jù)NY Upstate生物技術(shù)公司提供的ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在培養(yǎng)的GH4細(xì)胞中加入37%的甲醛培養(yǎng)10 min以使細(xì)胞核中的組蛋白與DNA充分交聯(lián)，然后用冷PBS沖洗細(xì)胞2次，收集細(xì)胞，以超聲降解法將細(xì)胞核中的DNA剪切至200～1 000 bp大小，然后以臺(tái)式離心機(jī)（半徑100 mm）對(duì)上述細(xì)胞剪切物進(jìn)行3 000 r/min離心10 min，然后進(jìn)一步稀釋?zhuān)總€(gè)樣品預(yù)先取20 μL用于估算DNA樣本量（input DNA）。剩余溶解物則以鮭魚(yú)精液DNA/蛋白G-瓊脂珠進(jìn)行純化，然后取一半純化液與抗乙酰化的組蛋白-3（AcH3）或抗Pit-1抗體進(jìn)行孵化，并與蛋白G-瓊脂糖珠充分混合，4 ℃搖動(dòng)過(guò)夜，以抗乙?；腁cH3抗體或抗Pit-1抗體進(jìn)行孵化，并行蛋白質(zhì)印跡或PCR分析，以未加入抗體孵化的共沉淀樣本作為陰性對(duì)照。若細(xì)胞內(nèi)Ik-1高表達(dá)后能導(dǎo)致染色質(zhì)去乙?；?，則PCR實(shí)驗(yàn)時(shí)無(wú)PCR產(chǎn)物。PCR所采用的引物如下：rGH，正向 （5’-GTGACCATTGCCCATAAACC-3’），反向（5’-TGCATGCCCTTTTTATACCC-3’），分別對(duì)應(yīng)于rGH基因啟動(dòng)子核苷酸序列的1522～1541和1738～1719節(jié)段，以320 bp GH啟動(dòng)子片段為PCR模板，以是否產(chǎn)生216 bp的PCR產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)GH啟動(dòng)子的（去）乙?；癄顟B(tài)（引物設(shè)計(jì)詳情請(qǐng)參考GeneBank No.X12967）。

1.7 統(tǒng)計(jì)處理 應(yīng)用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)皆以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Ik-1 抑制了GH基因的表達(dá) 先前的研究證實(shí)了Ik-1可以在垂體前葉組織表達(dá)。為了弄清Ik-1在GH基因表達(dá)調(diào)節(jié)中的作用，我們以Ik-1、Ik-6表達(dá)質(zhì)粒或它們的對(duì)照質(zhì)粒PcDNA3.1對(duì)GH4細(xì)胞進(jìn)行穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，然后進(jìn)行Northern blot和蛋白印記分析。結(jié)果顯示外源性表達(dá)的Ik-1抑制了GH基因 mRNA的表達(dá)（圖1A），同時(shí)也證實(shí)了Ik-1能抑制GH蛋白的表達(dá)（圖1B）。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Ik-1對(duì)GH基因的調(diào)節(jié)作用，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ik-1、Ik-6或其空白質(zhì)粒的GH4細(xì)胞注射入SCID鼠皮下，經(jīng)過(guò)2周體內(nèi)生長(zhǎng)，處死鼠取該瘤組織進(jìn)行免疫組化分析，結(jié)果顯示外源性Ik-1能夠抑制GH的表達(dá)，而Ik-6的作用則相反（圖1C所示）。為了弄清Ik-1抑制GH表達(dá)的分子機(jī)制，將穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Ik-1或Ik-6的GH4細(xì)胞分別與GH-luc質(zhì)粒進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染（48 h），然后進(jìn)行熒光素酶發(fā)光測(cè)定，結(jié)果顯示Ik-1能夠抑制GH啟動(dòng)子的活動(dòng)，而Ik-6的作用則相反（圖2）。

2.2 Ik-1 改變了GH基因啟動(dòng)子所在染色質(zhì)區(qū)域的乙酰化狀態(tài) GH基因啟動(dòng)子無(wú)Ik-1結(jié)合位點(diǎn)，Ik-1與GH啟動(dòng)子不直接結(jié)合［2］。為了弄清Ik-1抑制GH基因表達(dá)的分子機(jī)制，我們采用染色質(zhì)組蛋白免疫共沉淀（ChIP）和PCR來(lái)檢測(cè)Ik-1是否改變了GH基因啟動(dòng)子染色質(zhì)區(qū)域的乙?；癄顟B(tài)。GH4細(xì)胞經(jīng)過(guò)上述轉(zhuǎn)染后，通過(guò)ChIP-PCR證實(shí)了Ik-1能增強(qiáng)GH基因啟動(dòng)子的染色質(zhì)組蛋白H3的去乙?；癄顟B(tài)，而Ik-6則誘導(dǎo)了GH 啟動(dòng)子的乙?；癄顟B(tài)（圖3A）。而Ik-1的這一作用也因Ik-1削弱了Trichostatin-A對(duì)GH啟動(dòng)子所在染色質(zhì)區(qū)域的乙?；饔枚玫竭M(jìn)一步證實(shí)（圖3B）。 因此，ChIP-PCR結(jié)果顯示Ik-1抑制GH基因表達(dá)是經(jīng)由染色質(zhì)組蛋白的去乙?；饔枚鴮?shí)現(xiàn)的。

2.3 Ik-1阻礙了垂體因子Pit-1進(jìn)入染色質(zhì)與GH基因啟動(dòng)子結(jié)合 為進(jìn)一步澄清Ik-1的去乙?；饔?，我們檢測(cè)了Ik-1對(duì)Pit1與GH啟動(dòng)子結(jié)合能力的影響。ChIP-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)外源性表達(dá)的Ik-1能阻礙Pit1進(jìn)入染色質(zhì)與GH啟動(dòng)子結(jié)合（圖4A）。當(dāng)轉(zhuǎn)染Ik-1、Ik-6及其對(duì)照質(zhì)粒的GH4細(xì)胞和Pit1表達(dá)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后，通過(guò)熒光素酶發(fā)光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Ik-1抑制了GH啟動(dòng)子的活動(dòng)，而 Ik-6則升高了GH啟動(dòng)子的活動(dòng)（圖4B）。

3 討 論

Ik-1是一類(lèi)Kruppel家族鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，Ik-1是人淋巴細(xì)胞早期發(fā)育與分化過(guò)程中起關(guān)鍵作用的調(diào)節(jié)者［3-4］，小鼠缺乏Ik-1基因則會(huì)導(dǎo)致胸腺和外周淋巴結(jié)發(fā)育停止以及淋巴祖細(xì)胞和成熟B淋巴細(xì)胞完全缺乏［5-6］。如果野生型Ik-1基因發(fā)生錯(cuò)誤剪切，將會(huì)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)和功能截然不同的8種同工蛋白產(chǎn)物包括Ik-6（結(jié)構(gòu)殘缺型，不能和DNA結(jié)合），這樣的錯(cuò)誤剪切將造成淋巴停止發(fā)育和白血病的發(fā)生［4］。

圖1 外源性表達(dá)的Ik-1抑制了GH4細(xì)胞中GH mRNA和蛋白水平的表達(dá)Fig.1 Exogenous expressed Ik-1 suppresses the GH gene mRNA and protein expresson in pituitary mammosomatotroph GH4 cells(DAB, ×20)

圖2 外源性Ik-1表達(dá)抑制了GH4細(xì)胞GH啟動(dòng)子的活性Fig.2 Ik-1 confers inhibitory effects on GH promoter activity in GH4 cells

圖3 Ik-1改變GH基因啟動(dòng)子所在區(qū)域染色質(zhì)的去乙?；癄顟B(tài)，因而抑制了GH基因的表達(dá)Fig.3 Ik-1 inhibits expression of the GH gene by altering chromatin histone acetylation closed to the GH promoter

圖4 Ik-1增加了GH基因啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙?；癄顟B(tài)，從而阻礙了Pit-1進(jìn)入染色質(zhì)與GH基因啟動(dòng)子結(jié)合Fig.4 The inability of Pit1 to activate the GH promoter, consistent with restricted access to this promoter in the presence of exogenous Ik-1 overexpression

我們先前的研究已證實(shí)野生型Ik-1能在垂體前葉組織中表達(dá)，且在大約50%的垂體腺瘤患者組織中檢測(cè)出Ik-6，因此推斷垂體腫瘤的形成與進(jìn)展可能與Ik-1的錯(cuò)誤剪切有關(guān)［7］。垂體瘤細(xì)胞中的Ik-6蛋白功能與野生型Ik-1蛋白功能截然相反。例如當(dāng)Ik-1、Ik-6分別與FGFR4基因啟動(dòng)子結(jié)合時(shí)會(huì)產(chǎn)生截然不同的染色質(zhì)修飾作用，因而對(duì)一定的靶基因會(huì)產(chǎn)生活化或抑制作用［7-8］。在本次研究中，我們觀察了Ik-1對(duì)GH基因表達(dá)的影響，集中探討Ik-1調(diào)節(jié)GH基因表達(dá)的分子機(jī)制。研究證實(shí)，Ik-1能夠抑制生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)。但是，由于GH基因的啟動(dòng)子調(diào)控區(qū)缺乏Ik-1結(jié)合的特異位點(diǎn)，Ik-1蛋白不能與GH基因啟動(dòng)子直接結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)其表達(dá)，那么Ik-1是通過(guò)什么機(jī)制來(lái)抑制GH基因的表達(dá)？本研究顯示，Ik-1在垂體細(xì)胞中以特異方式抑制了GH基因的表達(dá)，這種抑制完全依賴于Ik-1引起的染色質(zhì)組蛋白易接近狀態(tài)（chromatin accessibility）的改變。當(dāng)外源性Ik-1表達(dá)后，導(dǎo)致GH基因啟動(dòng)子所在區(qū)域染色質(zhì)組蛋白的去乙?；饔迷鰪?qiáng)，Ik-1增強(qiáng)GH基因去乙?；癄顟B(tài)的作用又因其能夠抵消TSA引起的乙?；饔枚玫竭M(jìn)一步證實(shí)。本研究亦提示了Ik-1在垂體細(xì)胞中削弱TSA介導(dǎo)的組蛋白乙?；饔?，表明Ik-1的這種調(diào)節(jié)作用是基于GH獨(dú)特靶基因而產(chǎn)生的，Ik-1抑制靶基因的表達(dá)是基因特異性的［8-9］。事實(shí)上，Ik-1是在結(jié)構(gòu)致密的可容納有限的蛋白調(diào)節(jié)因子的染色質(zhì)內(nèi)與GH靶基因結(jié)合的，當(dāng)染色質(zhì)處于去乙?；癄顟B(tài)時(shí)，DNA與組蛋白在結(jié)構(gòu)上纏繞致密，不利于蛋白調(diào)節(jié)因子的進(jìn)入。研究證實(shí)垂體因子Pit-1能夠上調(diào)GH基因的表達(dá)，促進(jìn)生長(zhǎng)激素的分泌［10］。由于染色質(zhì)乙?；癄顟B(tài)的改變使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)重新塑造時(shí)，Ik-1能夠改變致密纏繞的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而影響Pit-1的進(jìn)入，Pit-1活化GH啟動(dòng)子的作用被抑制，故導(dǎo)致GH基因表達(dá)受制。這一研究結(jié)果將會(huì)為今后垂體腫瘤的臨床干預(yù)治療提供重要的參考和指導(dǎo)，為臨床靶向藥物治療的設(shè)計(jì)提供新的視野。隨著Ik-1作用的深入研究，將不斷地啟發(fā)我們對(duì)Ik-1整個(gè)家族成員在垂體早期發(fā)育、垂體干細(xì)胞自我更新以及垂體腫瘤轉(zhuǎn)化過(guò)程中的作用的重新認(rèn)識(shí)。鑒于Ik-1對(duì)生長(zhǎng)激素基因調(diào)節(jié)的特異性，在垂體瘤形成過(guò)程中，Ik-1是否也作用于其他激素分泌基因、以及是否Ik-1其他家族成員也參與了這些分子調(diào)控事件，有待于今后進(jìn)一步研究探索。

本研究結(jié)果表明，Ik-1和垂體因子包括Pit1之間形成特定的功能調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)節(jié)GH基因的表達(dá)。Ik-1抑制垂體GH基因的表達(dá)，是通過(guò)增加染色質(zhì)去乙?；癄顟B(tài)、阻抑垂體因子Pit-1進(jìn)入染色質(zhì)與GH啟動(dòng)子結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

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