人肝細胞生長因子基因轉(zhuǎn)染治療腦梗死的實驗研究

尤志珺, 劉 勇

隨著人口老年化的發(fā)展,腦血管疾病成為人類健康的三大殺手之一,但目前尚無理想的治療方法。對于缺血性腦卒中挽救缺血半暗帶是治療的關(guān)鍵,因此應(yīng)用促血管生成因子促進血管新生是一種非常有前景的治療方法。在刺激血管生成方面,文獻報道較多的是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF),但因其增加血腦屏障(bloodbrain barrier,BBB)通透性、加重腦缺血或誘發(fā)腦出血[1]而受到限制。肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor,HGF)是一種具有促進多種細胞增殖、運動、管腔形成和細胞形態(tài)發(fā)育等多種功能的細胞因子。近年研究發(fā)現(xiàn),HGF是最強的促血管內(nèi)皮細胞生長因子,具有促進血管內(nèi)皮細胞損傷的修復(fù)作用[2]。本課題采用將人肝細胞生長因子基因直接轉(zhuǎn)染至大腦中動脈閉塞(middle cerebralartery occlusion,MCAO)模型大鼠腦缺血半暗帶區(qū)的方法,探討人 HGF對腦梗死后學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)的機制,為基因治療缺血性腦血管病及血管性癡呆探索新的途徑和方法。

1 材料和方法

1.1 材料 選擇 22月齡純種健康 Wistar大鼠60只,體重 250～300g,雌雄各半,隨機分為 3組：假手術(shù)組 20只;模型轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組 20只;模型轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組 20只。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 參照 Lourbopoulos修改的 Koizumi結(jié)扎法,用尼龍線穿線法建立 MCAO模型[3,4]。假手術(shù)組不插入尼龍線,余同其他組。

1.2.2 質(zhì)粒構(gòu)建 RT-PCR擴增人肝臟中hHGF全長 cDNA片段(2.2KB),克隆入 pcDNA3.1(+)真核表達載體中,用脂質(zhì)體法將 pcDNA3.1(+)-hHGF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌,常規(guī)方法篩選出所要的克隆,純化質(zhì)粒,然后轉(zhuǎn)染入人神經(jīng)母細胞瘤(SH-SY5Y)細胞。培養(yǎng) 24h后,以 omega質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒備用。

1.2.3 人 HGF基因轉(zhuǎn)染至大鼠缺血半暗帶區(qū)

將 MCAO大鼠頭頂部剃毛、消毒,于前囟偏右旁開 5mm處鉆一顱孔,微量進樣器垂直進針 3.5mm(注射部位為鼠腦皮層下,相當于放射冠區(qū)),注入質(zhì)粒,然后縫合切口,精心飼養(yǎng)。同樣方法對照組大鼠注入空質(zhì)粒。

1.2.4 HGF基因表達水平的檢測 MCAO術(shù)后第 8天,每組隨機取 3只大鼠,斷頭取右腦,用SABC總核糖核酸(ribonucleic acid,RNA)提取系統(tǒng)(Ⅱ)提取腦組織中總 RNA,取 1μg總 RNA樣品,用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)(RT polymerase chain reaction,RT-PCR)試劑盒在 PCR擴增儀上,進行逆轉(zhuǎn)錄和擴增。擴增結(jié)束后取 5μl PCR產(chǎn)物上樣,在 1%瓊脂糖凝膠上進行電泳。RT-PCR根據(jù) Genebank的大鼠HGF基因 cDNA的序列設(shè)計引物如下：正義引物 5'ACA GCTTTT TGCCTTCGAGCTA 3'、反義引物 5'CAT CAA AGC CCT TGT CGG GAT A-3';內(nèi)參照GAPD的 PCR正義引物為 5'-TCC CTC AAG ATT GTC AGCAA-3'、反義引物 5'-AGA TCC ACA ACG GATACA TT-3',大小約309bp(以上引物均由北京賽百盛公司合成,PCRmarker為 Promega產(chǎn)品)。

1.2.5 缺血半暗帶區(qū) HGF基因蛋白表達水平的檢測 術(shù)后 7d標本固定,石蠟包埋,切片,采用免疫組化技術(shù)(SP法)嚴格按免疫組化試劑盒說明書行免疫組化染色,DAB顯色,檢測缺血半暗帶區(qū)HGF基因蛋白(Aviva Systems Bio.ARP44318_P050)表達水平。同時同樣的方法檢測假手術(shù)組半暗帶區(qū) HGF基因蛋白表達水平。Actin作為內(nèi)參蛋白。陽性信號為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒。

1.2.6 缺血半暗帶區(qū)的血管計數(shù) 采用免疫組化技術(shù)(SP法)進行 CD31(ABD Serotec,Clone TLD-3A12clone)血管內(nèi)皮細胞染色。顯微鏡下觀察缺血半暗帶區(qū),DAB顯色,陽性信號為胞漿內(nèi)棕黃色顆粒。50個高倍視野下計數(shù)血管數(shù),同樣方法計數(shù)假手術(shù)組的血管數(shù)。

1.2.7 梗死體積的測定 術(shù)后 24h,采用圖像分析軟件測量腦梗死體積,同時同樣方法分析測量假手術(shù)組腦梗死體積。

1.2.8 被動逃避試驗 術(shù)后 56d,利用大鼠喜愛黑暗的特性,設(shè)置兩間門相通的一暗一亮房,將大鼠放入亮房,當大鼠逃入暗房后將會受到 6mA的電流刺激而再次逃向亮房,經(jīng)訓(xùn)練后觀察其再次由亮房進入暗房的時間,以測定和比較組間的記憶能力。同樣方法測定和比較假手術(shù)組記憶能力。

2 結(jié) 果

2.1 熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染成功的 SH-SY5Y細胞 用純化的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人神經(jīng)母細胞瘤(SHSY5Y)細胞,培養(yǎng) 24h后,熒光顯微鏡下觀察 90%以上細胞呈現(xiàn)綠色熒光(見圖1),證明轉(zhuǎn)染成功。

2.2 在大鼠缺血半暗帶區(qū) Western免疫印跡證實人肝細胞生長因子轉(zhuǎn)染成功 把假手術(shù)組和空白質(zhì)粒組、轉(zhuǎn)染 hHGF的 SH-SY 5Y提取蛋白質(zhì),免疫印跡法證明只有轉(zhuǎn)染組在約 47.5KDA處陽性印跡表達(見圖2),證明轉(zhuǎn)染成功。

2.3 在大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)病理切片免疫組化證實表達人肝細胞生長因子蛋白的細胞的存在

免疫組化法顯示：人肝細胞生長因子彌漫強陽性表達于大鼠皮質(zhì)缺血半暗帶區(qū)的膠質(zhì)細胞的胞核和胞漿中,呈棕黃色顆粒(見圖3)。

2.4 人肝細胞生長因子基因能明顯促進缺血半暗帶區(qū)的新生血管生成,顯著減少梗死體積CD31免疫組化法顯示：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的半暗帶區(qū)血管計數(shù)顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組 (50.76/50HPF vs 40.67/50HPF)(P＜0.01)(見圖4),并經(jīng)測量轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的梗死面積顯著小于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(9.32%vs 23.68%)(P＜0.01)(見圖5)。

2.5 人肝細胞生長因子基因能促進腦卒中后學(xué)習(xí)記憶功能的恢復(fù) 被動逃避實驗觀察顯示,空白質(zhì)粒組組別的潛伏期明顯比模型轉(zhuǎn)染組要時間長(15.89±9.15s vs 27.30±12.51s)(P＜0.01),證明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的梗死后學(xué)習(xí)和記憶功能較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組明顯提高。

圖1 熒光顯微鏡下觀察到大鼠缺血區(qū)腦組織轉(zhuǎn)染成功的SH-SY 5Y細胞呈現(xiàn)綠色熒光

圖2 Western免疫印跡證明轉(zhuǎn)染的 SH-SY 5Y細胞在大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織成功表達人肝細胞生長因子

圖3 免疫組化證實SH-SY 5Y細胞在大鼠缺血半暗帶區(qū)腦組織轉(zhuǎn)染成功(SP法,高倍放大)

圖4 CD31免疫組化染色顯示轉(zhuǎn)染組血管高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組棕色為血管。A：轉(zhuǎn)染組血管;B：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組血管(SP法,中倍放大)

圖5 轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組梗死面積明顯大于轉(zhuǎn)染組。A：轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組;B：轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組(HE,中倍放大)

3 討 論

對于缺血性腦卒中患者,缺血后若有血管生成,尤其在缺血半暗帶區(qū)的血管新生,將大大提高腦卒中患者的存活率,因此應(yīng)用促血管生成因子促進血管的新生已經(jīng)成為一種非常有前景的基因治療方法。由于血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)方面的局限性,臨床應(yīng)用并不是很廣泛。近期研究表明肝細胞生長因子(HGF)是一種具有多種功能的細胞因子,參與組織修復(fù)和血管新生、抑制細胞凋亡、促進側(cè)支循環(huán),有人將其稱為分子搭橋術(shù)[5～7]。所以 HGF是目前治療缺血性腦血管病的最有前景的因子之一[8,9]。

針對 HGF對腦血管疾病的作用國內(nèi)外學(xué)者也有較多研究,Hayashi等[10]通過對大鼠腦缺血模型的研究發(fā)現(xiàn),大腦中動脈閉塞 1h后皮質(zhì)缺血半暗帶即有 HGF表達;3h后缺血皮質(zhì)和尾狀核 HGF表達水平逐漸增高;24h后達高峰,提示 HGF可能具有神經(jīng)保護作用。在本研究中,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的半暗帶區(qū) HGF蛋白表達水平顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和假手術(shù)組(P＜0.01),與上述國外研究結(jié)果基本一致。此外,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的半暗帶區(qū)血管計數(shù)顯著高于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組和假手術(shù)組(P＜0.01);而轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的梗死面積顯著小于轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(P＜0.01);說明人 HGF基因蛋白能夠在缺血半暗帶區(qū)表達,通過增加梗死區(qū)的血管數(shù)量,明顯縮小腦梗死體積,對腦梗死有良好的治療作用。這一點在國內(nèi)外許多研究中也得以證實。Akimoto等[11]的研究表明,外源性HGF能提高海馬 CA1區(qū)突觸長時程增強,從而在腦缺血時神經(jīng)元調(diào)節(jié)系統(tǒng)中發(fā)揮作用,可能與增大神經(jīng)元內(nèi) N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體介導(dǎo)的電流有關(guān)。Hayashi等[12]的實驗表明,腦室內(nèi)給予重組人 HGF可使大腦中動脈閉塞大鼠腦梗死區(qū)抗凋亡蛋白 Bcl-2表達明顯增加,凋亡細胞減少,新生血管增加,而梗死灶體積卻縮小,其機制可能與 HGF的抗凋亡和促血管生成作用有關(guān)。Shimamura等[13]通過基因轉(zhuǎn)染將人 HGF基因注入大腦中動脈閉塞動物模型蛛網(wǎng)膜下隙,發(fā)現(xiàn) HGF基因過度表達,梗死體積縮小,大腦皮質(zhì)毛細血管密度增加,血腦屏障破壞減少,腦水腫減輕。國內(nèi)靳繼德等[14]通過建立大鼠局灶性腦缺血模型,觀察攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒(Ad-HGF)對大鼠局灶性腦缺血的治療作用,實驗結(jié)果顯示 Ad-HGF治療組動物大腦缺血區(qū)明顯小于非治療組動物,證明 Ad-HGF能顯著縮小大鼠局灶性腦缺血區(qū)。

再者,Date等[15,16]的實驗表明,腦室內(nèi)注入人類重組 HGF能明顯提高微球腦栓塞動物模型的學(xué)習(xí)和記憶功能,減輕血管密度和數(shù)量的降低(尤其是直徑 ＜10μm的小血管);減輕因 FITC-白蛋白缺乏所致的梗死后早期血腦屏障破壞,TUNEL陽性細胞減少。Shimamura等[17]用血凝病毒將 HGF轉(zhuǎn)染慢性腦梗死大鼠,結(jié)果發(fā)現(xiàn) HGF在腦梗死后的記憶恢復(fù)中具有重要的作用,為基因治療慢性腦梗死提供了有力的證據(jù)。Takeo等[18]通過建立大鼠動脈栓塞模型和微栓塞模型,觀察 HGF對大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能、神經(jīng)細胞和內(nèi)皮細胞壞死的影響,發(fā)現(xiàn)HGF治療組通過阻止凋亡因子向神經(jīng)元的遷移阻止了缺血引起的海馬神經(jīng)細胞的凋亡,同時發(fā)現(xiàn)HGF通過阻止腦血管損傷,阻止了缺血區(qū)組織的變性,提高了試驗動物學(xué)習(xí)和記憶功能。在本研究中,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組的梗死后學(xué)習(xí)和記憶功能也明顯提高(P＜0.01),表明人類重組 HGF對腦梗死后學(xué)習(xí)和記憶功能的恢復(fù)也有較好作用。

以上各項研究主要是通過側(cè)腦室途徑或小腦延髓池途徑或蛛網(wǎng)膜下腔途徑注射外源基因,然而,這些目的基因的表達產(chǎn)物卻很難到達所需的治療部位-缺血半暗帶區(qū)域,因此,其治療作用將不能得到充分發(fā)揮。另外外源基因在非目的區(qū)域廣泛高效地表達,這無疑會增加基因治療的不安全性。再者病毒載體存在制備復(fù)雜、免疫原性高、毒性大和目的基因容量小等缺點,尤其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)應(yīng)用中,病毒載體的免疫原性和毒性所引起的不良反應(yīng)不容忽視。本實驗采用向缺血半暗帶(放射冠區(qū))直接注射外源基因質(zhì)粒,既簡便又安全,增強了目的基因的靶向性和安全性,克服了病毒載體的缺點。本研究為基因治療缺血性腦血管病及血管性癡呆提供了新的途徑和方法。

[1]Zhang ZG,Zhang L,Jiang Q,etal.VEGF enhances angiogenesis and promotes blood-brain barrier leakage in the ischemic brain[J].J Clin Invest,2000,106(7)：829-838.

[2]Morishita R,Nakamura S,Hayashi S,etal.Contribution of a vascular modulator,hepatocyte growth factor(HGF),to the pathogenesis of cardiovascular disease[J].JA theroscler Thromb,1998,4(3)：128-134.

[3]Lourbopoulos A,Karacostas D,Artemis N,etal.Effectiveness of a newmodified intraluminal suture for temporarymiddle cerebralartery occlusion in ratsofvariousweight[J].JNeurosci Methods,2008,173(2)：225-234.

[4]Kawamura S,Yasui N,Shirasawa M,etal.Ratmiddle cerebral artery occlusion using an intraluminal thread technique[J].Acta Neurochir(Wien),1991,109(3～4)：126-132.

[5]Rajagopalan S,Mohler ER,Lederman RJ,etal.Regional angiogenesis with vascular endothelial growth factor in peripheral arterial disease：a phase II random ized,double-blind,controlled study of adenoviral delivery of vascular endothelial growth factor 121 in patientswith disabling intermittent c laudication[J].Circulation,2003,108(16)：1933-1938.

[6]Hedman M,Hartikainen J,Syvanne M,etal.Safety and feasibility of catheter-based local intracoronary vascular endothelial growth factor gene transfer in the prevention of postangioplastyand in-stent restenosis and in the treatment of chronic myocardial ischemia：phase II results of the Kuopio Angiogenesis Trial(KAT)[J].Circulation,2003,107(21)：2677-2683.

[7]Okura Y,Arimoto H,Tanuma N,etal.Analysisof neurotrophic effects of hepatocyte growth factor in the adult hypoglossal nerve axotomy model[J].Eur JNeurosci,1999,11(11)：4139-4144.

[8]Shimamura M,Sato N,Oshima K,etal.Novel therapeutic strategy to treat brain ischemia：overexpression of hepatocyte growth factor gene reduced ischem ic injury without cerebral edema in ratmodel[J].Circulation,2004,109(3)：424-431.

[9]Hayashi S,Morishita R,Nakamura S,etal.Potential role of hepatocyte growth factor,a novel angiogenic growth factor,in peripheralarterial disease：downregulation of HGF in response to hypoxia in vascular cells[J].Circulation,1999,100(Suppl 19)：301-308.

[10]Hayashi T,Abe K,SakuraiM,etal.Inductions of hepatocyte growth factor and its activator in rat brain with permanentmiddle cerebral artery occlusion[J].Brain Res,1998,799(2)：311-316.

[11]Akimoto M,BabaA,Ikeda-Matsuo Y,etal.Hepatocyte growth factor asan enhancer of nmda currents and synaptic plasticity in the hippocampus[J].Neuroscience,2004,128(1)：155-162.

[12]HayashiK,MorishitaR,Nakagam iH,etal.Gene therapy for preventing neuronal death using hepatocyte growth factor：in vivo gene transfer of HGF to subarachnoid space prevents delayed neuronal death in gerbil hippocampal CA 1 neurons[J].Gene Ther,2001,8(15)：1167-1173.

[13]Shimamura M,Sato N,Oshima K,etal.Novel therapeutic strategy to treat brain ischemia：overexpression of Hepatocyte growth factor gene reduced ischem ic injury without cerebral edema in rat model[J].Circulation,2004,109(3)：424-431.

[14]靳繼德,哈小琴.攜帶人肝細胞生長因子基因的重組腺病毒對大鼠局灶性腦缺血治療的實驗研究[J].軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊,2003,27(6)：406-409.

[15]Date I,Takagi N,Takagi K,etal.Hepatocyte growth factor attenuates cerebral ischemia-induced learning dysfunction[J].Biochem Biophys Res Commun,2004,319(4)：1152-1158.

[16]Date I,Takagi N,TakagiK,etal.Hepatocyte growth factor improved learning andmemory dysfunction ofmicrosphere-embolized rats[J].JNeurosci Res,2004,78(3)：442-453.

[17]Shimamura M,Sato N,Waguri S,etal.Gene transfer of hepatocyte growth factor gene improves learning and memory in the chronic stage of cerebral infarction[J].Hypertension,2006,47(4)：742-751.

[18]Takeo S,Takagi N,Takagi K.Ischem ic brain injury and hepatocyte growth factor[J].Yakugaku Zasshi,2007,127(11)：1813-1823.