青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度的影響

譚祥華,黃秀深,植品隆,楊光富

（成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075）

青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度的影響

譚祥華,黃秀深,植品隆,楊光富

（成都中醫(yī)藥大學(xué),四川 成都 610075）

目的通過檢測(cè)C57/BL荷瘤小鼠的基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP9）、血管緊張素（Ang-Ⅱ）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的含量,觀察青莪湯對(duì)Lewis肺癌的生長(zhǎng)、腫瘤微血管生成及轉(zhuǎn)移的影響。方法以C57/BL荷瘤小鼠為研究對(duì)象,以順鉑為陽性對(duì)照,以生理鹽水為陰性對(duì)照,觀察青莪湯各劑量組對(duì)Lewis肺癌的MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度的作用。結(jié)果青莪湯的低劑量能抑制Lewis肺癌的生長(zhǎng),且能抑制Ang-Ⅱ、EGF的活性,與模型組比較（P＜0.05）,青莪湯各劑量組均能抑制MMP9的活性,與模型組比較（P＜0.01）。青莪湯的中、低劑量、順鉑組能顯著抑制腫瘤微血管的生長(zhǎng),與模型對(duì)照組比較（P＜0.001）。結(jié)論青莪湯能抑制Lewis肺癌的轉(zhuǎn)移,其機(jī)制可能與抑制MMP9、Ang-Ⅱ、EGF的活性,降低腫瘤的微血管密度有關(guān)。

青莪湯;MMP9;Ang-Ⅱ;EGF;微血管密度;大鼠

青莪湯由青蒿、莪術(shù)等中藥材組成,為成都中醫(yī)藥大學(xué)方劑教研室研制的經(jīng)驗(yàn)方,其在臨床治療腫瘤方面具有很好的療效。本實(shí)驗(yàn)采用Lewis肺癌自轉(zhuǎn)移模型,選擇了MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度作為研究指標(biāo),探討青莪湯對(duì)Ang-Ⅱ 、MMP9、EGF、微血管密度在肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 Lewis肺癌瘤株,購自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。健康C57小鼠（20±2）g,雌雄各半,購自四川大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,合格證號(hào):SCXK-09-2006。青莪湯中青蒿、莪術(shù)等中藥,購于北京同仁堂成都總府店,水煎成含1 mL/g。順鉑注射液,江蘇豪森藥業(yè)有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號(hào)090104。血管緊張素（AngiotensinⅡ）試劑盒,美國(guó)RD公司產(chǎn)品。表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor,EGF）試劑盒,美國(guó)RD公司產(chǎn)品?；|(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMP9）試劑盒,美國(guó)RD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物試驗(yàn) 取接種Lewis肺癌瘤株10～14 d的C57/BL荷瘤小鼠,脫頸椎處死,無菌條件下取瘤組織,按腫瘤質(zhì)量（g）與生理鹽水（mL）1∶3制備瘤細(xì)胞懸液,另取C57/BL小鼠50只（20±2）g,雌雄各半,全部小鼠均于右腋下接種Lewis肺癌瘤細(xì)胞懸液,每只0.2 mL,再隨機(jī)分為空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、青莪湯高劑量組、中劑量組、低劑量組,每組10只,于接種后第2 d開始給藥,青莪湯低、中、高劑量組均給予0.2 mL/只,青莪湯劑量見表1～表5,其相當(dāng)于臨床成人用量的5倍、10倍、20倍?？瞻捉M給予生理鹽水0.2 mL/只,連續(xù)給藥18 d[1],順鉑組予以腹腔注射,隔日給藥1次,共給藥5次,給藥劑量以生藥量計(jì)算,見表1～表5。于20 d眼球取血,離心,取小鼠血清進(jìn)行MMP9、Ang-Ⅱ、EGF檢測(cè)。處死小鼠,剝?nèi)∧[瘤進(jìn)行抑瘤率的檢測(cè)。剝?nèi)∧[瘤及肺組織進(jìn)行微血管密度檢測(cè)。

1.2.2 抑瘤率的檢測(cè) 眼球取血,處死小鼠,剝離腫瘤,稱重。

抑瘤率=（平均空白組瘤重-平均青莪湯組瘤重）/平均空白組瘤重×100%

1.2.3 MMP9的檢測(cè) 取小鼠血清,用ELISA法,用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 Ang-Ⅱ的檢測(cè) 取小鼠血清,用ELISA法,用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 EGF的檢測(cè) 取小鼠血清,用ELISA法,用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.6 腫瘤及肺微血管密度的檢測(cè) 腫瘤組織微血管密度（MVD）檢測(cè)取部分腫瘤組織,4%多聚甲醛固定,F8常規(guī)免疫組化染色,在顯微鏡下記數(shù)10個(gè)視野內(nèi)腫瘤微血管數(shù)目,以平均每高倍鏡（×200）視野的微血管個(gè)數(shù)表示MVD[2-3]。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 15統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,抑瘤率采用公式:（對(duì)照組瘤重-實(shí)驗(yàn)組瘤重）/對(duì)照組瘤重,分別計(jì)算之后進(jìn)行方差分析,MMP9、Ang-Ⅱ、EGF、微血管密度均采用方差分析。

2 結(jié)果

2.1 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影響 見表1。

表1 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影響（±s,n=10）

表1 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠抑瘤率的影響（±s,n=10）

注:與模型組比較,#P＜0.05,##P＜0.01。

組 別 給藥途徑/（g/kg） 瘤重 抑瘤率/%劑量模 型 對(duì) 照 組 ig — 7.280 4±2.227 9 —順 鉑 組 ip 0.02 1.324 3±1.321 8## 81.81青莪湯低劑量組 ig 1.00 3.958 5±1.866 2# 45.63青莪湯中劑量組 ig 5.00 6.791 0±2.578 5 6.72青莪湯高劑量組 ig 10.00 7.440 5±1.942 0 —

2.2 青莪湯對(duì)C57/BL荷瘤Lewis肺癌小鼠MMP-9的影響 見表2。

表2 青莪湯對(duì) Lewis肺癌小鼠MMP-9的影響（±s,n=10）

表2 青莪湯對(duì) Lewis肺癌小鼠MMP-9的影響（±s,n=10）

注:與模型組比較,###P＜0.001。

組 別 給藥途徑給藥劑量/（g/kg）MMP9/ug模 型 對(duì) 照 組 ig — 73.098 7±17.193 4順 鉑 組 ip 0.02 32.573 5±27.730 0###青莪湯低劑量組 ig 1.00 20.259 5±9.179 8###青莪湯中劑量組 ig 5.00 28.670 1±15.483 3###青莪湯高劑量組 ig 10.00 31.915 9±11.423 7###

2.3 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠Ang-Ⅱ的影響 見表3。

表3 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠Ang-Ⅱ的影響（±s,n=10）

表3 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠Ang-Ⅱ的影響（±s,n=10）

注:與模型組比較,##P＜0.01。

組 別 給藥途徑給藥劑量/（g/kg）Ang-Ⅱ/（ng/L）模 型 對(duì) 照 組 ig — 649.7045±175.647 3順 鉑 組 ip 0.02 692.557 6±82.963 1青莪湯低劑量組 ig 1.00 437.671 3±44.709 6##青莪湯中劑量組 ig 5.00 511.470 8±57.752 8青莪湯高劑量組 ig 10.00 424.542 7±30.432 6

2.4 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠EGF的影響 見表4。

表4 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠EGF的影響（±s,n=10）

表4 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠EGF的影響（±s,n=10）

注:與模型組比較,###P＜0.001。

組 別 給藥途徑給藥劑量/（g/kg）EGF/（ng/L）模 型 對(duì) 照 組 ig — 276.656 4±55.421 3順 鉑 組 ip 0.02 203.386 5±44.155 0青莪湯低劑量組 ig 1.00 211.037 2±77.055 3###青莪湯中劑量組 ig 5.00 200.443 9±40.024 6青莪湯高劑量組 ig 10.00 203.386 6±44.156 6

2.5 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠微血管密度的影響見表5。

表5 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠微血管密度的影響（±s,n=10）

表5 青莪湯對(duì)Lewis肺癌小鼠微血管密度的影響（±s,n=10）

注:與模型組比較,##P＜0.01,###P＜0.001。

組 別 給藥途徑劑量/（g/kg） 瘤血管數(shù) 肺血管數(shù)模 型 對(duì) 照 組 ig — 45.700 0±18.064 5 44.558 8±13.366 6順 鉑 組 ip 0.02 21.600 0±6.350 0###24.833 3±5.408 1###青莪湯低劑量組 ig 1.00 27.166 7±7.543 3###26.233 3±7.784 5###青莪湯中劑量組 ig 5.00 36.933 3±8.509 4## 36.520 0±8.832 3###青莪湯高劑量組 ig 10.00 48.500 0±12.050 3 59.300 0±18.046 2

3 討論

肺癌屬于中醫(yī)“肺積”“息賁”等范疇。氣（氣滯）、痰（痰凝）、瘀（血瘀）、毒（毒聚）、虛（正氣虧虛）是其基本病因。肺癌患者多表現(xiàn)為氣陰兩虛、邪毒內(nèi)聚、瘀血阻滯,臨床多以清熱解毒、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀為主要大法辨證論治。青莪湯由人參、青蒿、莪術(shù)、三七等藥物組成。全方配伍精良,祛邪而不傷正、扶正而不留邪。具有益氣活血、化瘀散結(jié)之功,體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治的原則,在臨床運(yùn)用中收效良好。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,青莪湯能抑制腫瘤的發(fā)生和生長(zhǎng),其抗癌能力與劑量呈一定的負(fù)相關(guān),其作用機(jī)理可能與下調(diào)MMP9、EGF、Ang-Ⅱ有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與臨床療效一致[4-5],為青莪湯的臨床運(yùn)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù),也為進(jìn)一步研發(fā)本方提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。青莪湯能降低MMP9的含量,但本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明,青莪湯僅在低劑量時(shí),具有抑瘤作用和下調(diào)Ang-Ⅱ、EGF的作用,中、高劑量作用不明顯,甚至高劑量具有促進(jìn)肺血管生成作用,可能與樣本含量較少有關(guān)。筆者認(rèn)為,在進(jìn)一步的臨床與實(shí)驗(yàn)研究過程中,應(yīng)選取合適的劑量,增大樣本量,采用不同的給藥途徑、不同的模型,并與體外實(shí)驗(yàn)相結(jié)合,更深一步研究青莪湯抗腫瘤的作用機(jī)理。

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R285.5

A

1007-4813（2010）01-0014-02

（

2009-12-01）