復(fù)生康膠囊微生物限度檢查法方法驗(yàn)證

顏棟林,李 萍,蘭 茜

（南寧食品藥品檢驗(yàn)所,廣西南寧 530001）

復(fù)生康膠囊微生物限度檢查法方法驗(yàn)證

顏棟林,李 萍,蘭 茜

（南寧食品藥品檢驗(yàn)所,廣西南寧 530001）

目的建立復(fù)生康膠囊微生物限度檢查方法。方法 以3株細(xì)菌、2株真菌對(duì)復(fù)生康膠囊進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果采用常規(guī)法大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%,枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿）的回收率達(dá)到70%以上,控制菌采用常規(guī)法進(jìn)行檢驗(yàn),可檢出大腸埃希菌。結(jié)論經(jīng)驗(yàn)證復(fù)生康膠囊微生物限度檢查法應(yīng)采用培養(yǎng)基稀釋法檢查細(xì)菌;常規(guī)法檢查霉菌、酵母菌和控制菌。

復(fù)生康膠囊;微生物限度;方法驗(yàn)證;回收率;培養(yǎng)基稀釋法;常規(guī)法

復(fù)生康膠囊主要成分為蒲葵子、喜樹(shù)果、莪術(shù)、柴胡、絞股藍(lán)、香菇、黃芪、甘草、磷酸氫鈣[1-3]。具有活血化瘀、健脾消積功效,用于胃癌、肝癌的治療,能增強(qiáng)放療、化療的療效,增強(qiáng)機(jī)體免疫功能,改善臨床癥狀。處方中的莪術(shù)、柴胡有一定的抑菌作用[4-5]。根據(jù)其用藥途徑、成分和制法,按照2005年版《中國(guó)藥典》一部附錄XⅢC微生物限度檢查法[6],應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定,及控制菌大腸埃希菌檢查,建立微生物限度檢查方法,并加以驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)菌種 枯草芽孢桿菌CMCC（B）63501、金黃色葡萄球菌 CMCC（B）26003、大腸埃希菌 CMCC（B）44102、白色念珠菌 CMCC（F）98001、黑曲霉 CMCC（F）98003,均由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供。

1.2 樣品 復(fù)生康膠囊:批號(hào):051101、060101、060102;由廣西昌弘制藥有限公司生產(chǎn)。

1.3 培養(yǎng)基及稀釋劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基,玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基,營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）,膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基,改良馬丁培養(yǎng)基,改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基,MUG培養(yǎng)基,曙紅亞甲藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基（EMB）,由廣西食品藥品檢驗(yàn)所提供,按干燥培養(yǎng)基瓶簽方法配制;pH 7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液,0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液按《中國(guó)藥典》2005年版二部附錄方法配制。

2 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法的建立及驗(yàn)證

2.1 菌液制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)24～48h的白色念珠菌液體培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用;取經(jīng)25℃培養(yǎng)1周的黑曲霉斜面培養(yǎng)物,加10 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液洗下霉菌孢子,吸取菌液用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成每1 mL含菌數(shù)為50～100 cfu/mL的菌懸液,備用。

2.2 供試液的制備方法 取樣品10 g,加pH 7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液稀釋至100 mL,制備成溶解均勻的1∶10的供試液。

常規(guī)法:取供試液1 mL注皿。

培養(yǎng)基稀釋法:取供試液1 mL注入2個(gè)平皿中（0.5 mL/皿）。

2.3 回收率試驗(yàn) 試驗(yàn)組:取規(guī)定量供試液及50～100 CFU各試驗(yàn)菌,分別注入同一平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度,平行制備2個(gè)平皿。細(xì)菌培養(yǎng)24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h。

菌液組:取50～100 CFU各試驗(yàn)菌注入平皿中,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度,細(xì)菌培養(yǎng)24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h,測(cè)定所加入的試驗(yàn)菌數(shù),平行制備2個(gè)平皿。

供試品對(duì)照組:取規(guī)定量供試液,立即傾注瓊脂培養(yǎng)基,待凝固后,置規(guī)定溫度,細(xì)菌培養(yǎng)24～48 h,白色念珠球菌和黑曲霉培養(yǎng)48～72 h,測(cè)定供試品本底菌數(shù)。

2.4 方法的確定

2.4.1 常規(guī)法 見(jiàn)表1。

表1 復(fù)生康膠囊常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果 CFU/皿

從表1表明,常規(guī)法對(duì)大腸埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率試驗(yàn)均高于70%,可采用常規(guī)法對(duì)復(fù)生康膠囊霉菌及酵母菌數(shù)計(jì)數(shù)?？莶菅堪麠U菌、金黃色葡萄球菌的回收率均低于70%,表明該法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)不可行。

2.4.2 培養(yǎng)基稀釋法 見(jiàn)表2。

表2 培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿） CFU/皿

表2表明,采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5 mL/皿）,金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的回收率達(dá)到70%以上,故可采用該法進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)。

2.5 細(xì)菌數(shù)、霉菌和酵母菌數(shù)測(cè)定方法驗(yàn)證 見(jiàn)表3。

表3 3批復(fù)生康膠囊回收率試驗(yàn)結(jié)果 %

表3表明,采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿）,進(jìn)行細(xì)菌微生物限度檢驗(yàn),3種試驗(yàn)菌回收率均大于70%。霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法為常規(guī)法,其2種規(guī)定試驗(yàn)菌回收率均大于70%。方法可行。

3 控制菌檢驗(yàn)方法的建立及驗(yàn)證

試驗(yàn)組:取1∶10供試液10 mL接種至100 mL膽鹽乳糖培養(yǎng)基,同時(shí)加入大腸埃希菌10～100 CFU,35℃培養(yǎng)24～48 h。取培養(yǎng)物0.2 mL接種至含5 mL MUG培養(yǎng)基的試管中,35℃培養(yǎng)24 h,360 nm紫外燈下觀察熒光,然后進(jìn)行靛基質(zhì)試驗(yàn),觀察結(jié)果;另取培養(yǎng)物劃線接種于曙紅亞甲藍(lán)（EMB）平板,35℃培養(yǎng)18～24 h,觀察其菌落形態(tài)。

陰性菌對(duì)照組:取金黃色葡萄球菌作為陰性對(duì)照試驗(yàn)菌,方法同試驗(yàn)組。

經(jīng)膽鹽乳糖培養(yǎng)基增菌培養(yǎng)后,試驗(yàn)組與陰性對(duì)照組相比較有明顯的變化,試驗(yàn)組有明顯產(chǎn)酸產(chǎn)氣現(xiàn)象,結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 大腸埃希菌檢查常規(guī)法試驗(yàn)結(jié)果

表4表明,采用常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn),方法成立。

4 3批復(fù)生康膠囊的微生物限度檢查

按上述所建立的復(fù)生康膠囊微生物限度檢查法,對(duì)3批樣品進(jìn)行檢驗(yàn),細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)均小于10個(gè)/g,未檢出大腸埃希菌。

5 討論

5.1 在對(duì)藥品進(jìn)行微生物限度檢查方法的驗(yàn)證時(shí),采用預(yù)試驗(yàn)方法對(duì)驗(yàn)證用菌株抑菌活性的強(qiáng)弱進(jìn)行預(yù)測(cè),可為正式試驗(yàn)的方法提供依據(jù),同時(shí)可以減少工作量及試藥、試劑的浪費(fèi),提高工作效率。

5.2 由于藥品中的污染菌種類繁多,不同藥品對(duì)不同種類的細(xì)菌、霉菌的抑制作用強(qiáng)弱程度不同,不同藥品處方成分及其各成分的量不同等因素,對(duì)微生物的生長(zhǎng)影響不一。復(fù)生康膠囊處方中的莪術(shù)、柴胡對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有一定的抑菌作用,但抑菌活性強(qiáng)度不強(qiáng),在常規(guī)法達(dá)不到藥典要求時(shí),采用培養(yǎng)基稀釋法即可以使這兩種菌的試驗(yàn)回收率達(dá)到70%以上。

5.3 經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證確定復(fù)生康膠囊微生物限度檢查方法可按以下進(jìn)行,培養(yǎng)基稀釋法（0.5mL/皿）測(cè)定細(xì)菌數(shù),常規(guī)法測(cè)霉菌及酵母菌數(shù);采用常規(guī)法進(jìn)行大腸埃希菌檢驗(yàn)。

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[1]高鵬,徐立春,陳平,等.莪術(shù)醇生物構(gòu)建自體瘤苗治療晚期胃癌患者近期療效研究[J].吉林中醫(yī)藥.2008,28（1）:54-58.

[2]李鴻燕.小柴胡湯為主治療慢性萎縮性胃炎86例臨床觀察[J].吉林中醫(yī)藥,2006,26（1）:20.

[3]宗秀芝,于晶.黃芪治療心血管疾病的作用機(jī)理[J].吉林中醫(yī)藥,2008,28（8）:601.

[4]袁長(zhǎng)津,盧芳國(guó),朱應(yīng)武.小柴胡湯及其加減方體外抗菌作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2005,11（10）:54-55.

[5]魏玉平,駱志成.莪術(shù)揮發(fā)油體外抗念珠菌活性的研究[J].中國(guó)麻風(fēng)皮膚病雜志,2005,21（7）:524-526.

[6]國(guó)家藥典委員會(huì).中國(guó)藥典一部[S].2005:附錄XⅢC:70-77.

R282

A

1007-4813（2010）01-0131-02

顏棟林（1970-）,男,大學(xué)本科,主管藥師。研究方向:食品藥品標(biāo)準(zhǔn)研究。

（

2009-10-15）