可注射型生物蛋白膠包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞工程化組織的體外實驗＊

王晶瑩 宋泉生 朱靜琳 韓曉光 楊燕琳宋純理

(北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科,北京 100191)

可注射型生物蛋白膠包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞工程化組織的體外實驗＊

王晶瑩 宋泉生 朱靜琳 韓曉光 楊燕琳①宋純理＊＊

(北京大學(xué)第三醫(yī)院骨科,北京 100191)

目的構(gòu)建可注射型生物蛋白膠包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞的工程化組織,體外培養(yǎng)并研究其生物學(xué)特性,探討將可注射型生物蛋白膠作為組織工程支架用于臨床的實驗基礎(chǔ)。方法體外培養(yǎng)澆鑄有骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物蛋白膠,通過倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡觀察載體內(nèi)細(xì)胞生長及載體降解情況,5-溴脫氧尿苷 (5-Bromodeocyuridine,BrdU)摻入標(biāo)記后免疫組化等方法研究可注射型載體內(nèi)包埋細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果骨髓基質(zhì)細(xì)胞包埋于生物蛋白膠內(nèi)能很好地存活并增殖,2 d后細(xì)胞呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài);6 d后生物蛋白膠邊緣部分開始降解,細(xì)胞脫落至培養(yǎng)板;體外培養(yǎng) 14 d,細(xì)胞生長良好,大部分生物膠降解,脫落的細(xì)胞增多,貼壁生長的細(xì)胞形態(tài)正常;3周后生物蛋白膠完全降解。結(jié)論生物蛋白膠聚合后包埋的種子細(xì)胞能夠正常增殖,生物蛋白膠是一種理想的適用于微創(chuàng)方法修復(fù)組織的可注射型組織工程培養(yǎng)和移植的支架。

生物蛋白膠; 骨髓基質(zhì)細(xì)胞; 組織工程; 支架

組織缺損一直是困擾臨床的難題,一些組織如骨、軟骨等損傷引起的缺損尤其是大尺寸的缺損,自身修復(fù)的能力有限。組織工程的迅速發(fā)展,為這一難題提供了新的解決途徑。常規(guī)的組織工程是將種子細(xì)胞體外加載到載體上,細(xì)胞丟失嚴(yán)重,且耗時較長。載體材料的選擇是制約組織工程發(fā)展的一個重要因素,尋找能充分發(fā)揮組織再生潛力的支架材料是組織工程研究領(lǐng)域的核心內(nèi)容之一。理想的組織工程細(xì)胞支架應(yīng)具備以下特性:與種子細(xì)胞和宿主組織有良好的組織相容性;具有三維立體結(jié)構(gòu);具有可塑性和良好的生物可降解性。而生物蛋白膠復(fù)合以上幾種特點。如能采用微創(chuàng)外科技術(shù),采用注射的方法,使種子細(xì)胞在體內(nèi)復(fù)合將具有廣闊的應(yīng)用前景。生物蛋白膠又稱纖維蛋白黏合劑,是一種低抗原的生物大分子材料,具有良好的生物相容性,同時具有很好的可塑性,易于降解。纖維蛋白膠注射后聚合成形,可用于臨床尤其是微創(chuàng)外科中止血,減少創(chuàng)面滲液,還可用于填充組織缺損以及覆蓋和保護手術(shù)創(chuàng)面,促進創(chuàng)傷愈合,防止粘連,具有良好的效果[1,2]。本研究擬構(gòu)建可注射型生物蛋白膠澆鑄骨髓基質(zhì)細(xì)胞的工程化組織,體外培養(yǎng)并研究其生物學(xué)特性,探討其作為細(xì)胞培養(yǎng)支架的可行性,為應(yīng)用于臨床提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM培養(yǎng)基 (Gibco公司),胎牛血清 (北京百靈克生物技術(shù)公司),胰蛋白酶 (Sigma公司),醫(yī)用生物蛋白膠 (廣州倍特生物技術(shù)有限公司),青霉素、鏈霉素 (山東魯抗制藥股份有限公司),5-溴脫氧尿苷 (5-Bromodeocyuridine,BrdU)及抗體,冷凍組織包埋劑 (TBS,北京中杉金橋生物技術(shù)公司),碘化丙啶 (propidium iodine,PI),雙醋酸熒光素(fluorescein diacetate,FDA)(京欣經(jīng)科生物技術(shù)有限公司)

倒置相差顯微鏡 (Olympus,日本),激光共聚焦顯微鏡 (Leica,德國),冰凍切片機 (Leica,德國)。

健康雌性 BLAB-C小鼠,8周齡,體重 (9±0.5),共 12只,購買并飼養(yǎng)于北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實驗動物中心,飼養(yǎng)級別一級。

1.2 方法

1.2.1 骨髓基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng) 8周雌性BALB-C小鼠拉頸處死,75%酒精浸泡消毒,無菌條件下取雙側(cè)股骨、脛骨,用咬骨鉗分別咬除股骨、脛骨兩端的干骺端,DMEM完全培養(yǎng)液沖洗髓腔,充分吹打成細(xì)胞懸液,細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),接種于 25 cm2培養(yǎng)瓶,接種密度為 6×106個細(xì)胞 /cm2(包含血細(xì)胞)。5%CO2,37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。第 3天輕輕吸出懸浮細(xì)胞,更換培養(yǎng)液。以后每 2～3 d更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2 注射型包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞生物蛋白膠的構(gòu)建與體外培養(yǎng) 第 3代骨髓基質(zhì)細(xì)胞融匯至80%～90%時,0.25%胰酶消化細(xì)胞 3 min,含血清的培養(yǎng)液終止消化,反復(fù)漂洗,收集細(xì)胞,細(xì)胞計數(shù)板計數(shù),約 107個骨髓基質(zhì)細(xì)胞混于 A管內(nèi)生物蛋白膠 (主體膠,約 5 ml,主要含有纖維蛋白原復(fù)合物和Ⅻ因子),與等量的 B管成分 (催化劑,主要含有凝血敏、氯化鈣等),注射后兩管成分混合,凝固成澆鑄有骨髓基質(zhì)細(xì)胞的凝膠,培養(yǎng)板中加入完全培養(yǎng)液,5%CO2,37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察生物蛋白膠中骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生長情況及支架降解情況。根據(jù)培養(yǎng)液的顏色,及時更換培養(yǎng)液。

1.2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察 根據(jù)活細(xì)胞雙醋酸熒光素 (fluorescein diacetate,FDA)染色呈綠色熒光,死亡細(xì)胞碘化丙啶 (propidium iodine,PI)染色呈紅色熒光的特點[3],利用激光共聚焦顯微鏡的層切功能,可以觀察可注射型纖維蛋白膠載體內(nèi)不同層面澆鑄細(xì)胞的存活情況。熒光染液配制[3]:PI 5 mg溶于 100 ml PBS溶液作為貯備液,避光保存;FDA 1 mg/ml溶于丙酮作為貯備液,冰凍保存,用前磷酸緩沖液 (PBS)1∶4000稀釋。

分別在細(xì)胞澆鑄 1、3 d后,PBS液漂洗細(xì)胞生物蛋白膠聚合體,聚合體置于 2 ml PBS液中,滴加PI母液,終濃度為 5μg/ml,染色 3 min;FDA稀釋液染色 5 min。染色后激光共聚焦顯微鏡觀察,層切間距為 10μm。

1.2.4 BrdU細(xì)胞標(biāo)記免疫組化 為進一步觀察生物蛋白膠載體內(nèi)澆鑄的細(xì)胞是否能夠增殖,生物蛋白膠聚合 3 d后,加入 250μg/mlBrdU緩沖液,終濃度為 10μg/ml,避光,37℃孵箱孵育過夜后,4%多聚甲醛固定 10 min,TBS冷凍組織包埋劑包埋后冰凍切片,切片厚度 10μm。

PBS液漂洗 5 min;3%H2O2-甲醇室溫 30 min;3%Triton-X 100/PBS破膜;封閉液室溫封閉 30 min;BrdU抗體 4℃過夜;生物素標(biāo)記的二抗 37℃孵育 1 h;PBS漂洗后 HRP標(biāo)記的三抗 37℃孵育 1 h;PBS漂洗后 DAB顯色 3～5 min;脫水,透明,封片,光學(xué)顯微鏡觀察并攝片。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)的倒置相差顯微鏡觀察

可注射型復(fù)合骨髓基質(zhì)細(xì)胞的纖維蛋白膠在溶液A與溶液 B混合后很快形成凝膠 (大約 30 s)。倒置相差顯微鏡下,凝膠呈半透明狀,可見澆鑄在纖維蛋白膠內(nèi)的細(xì)胞?；罴?xì)胞包埋后,細(xì)胞培養(yǎng)液消耗比普通 24孔板明顯加快,培養(yǎng) 1～2 d后,細(xì)胞培養(yǎng)液顏色即變黃,而普通貼壁培養(yǎng)一般 3～4 d換液。

可注射型生物蛋白膠載體活細(xì)胞澆鑄 1 d后,細(xì)胞存活在生物膠內(nèi),細(xì)胞透亮,以球形細(xì)胞為主。2 d后部分細(xì)胞在載體內(nèi)伸出偽足,呈多角形或梭形,倒置相差顯微鏡下,細(xì)胞透亮,細(xì)胞狀態(tài)良好。6 d后生物蛋白膠聚合物邊緣部分開始逐漸降解,部分細(xì)胞脫落后貼附于培養(yǎng)板繼續(xù)生長,呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài),細(xì)胞狀態(tài)良好。培養(yǎng)至 14 d時,生物蛋白膠聚合物大部分崩解成碎片,大部分細(xì)胞脫落,貼附于培養(yǎng)板,脫落的細(xì)胞貼壁生長良好 (圖1)。3周后生物蛋白膠完全降解。

圖 1 倒置相差顯微鏡下觀察包埋有骨髓基質(zhì)細(xì)胞的生物蛋白膠 A.活細(xì)胞澆鑄 1 d,細(xì)胞存活良好;B.活細(xì)胞澆鑄 6 d,生物膠邊緣部分降解;C.活細(xì)胞澆鑄 14 d,大部分生物膠降解;D.活細(xì)胞澆鑄 3周,生物蛋白膠完全降解,脫落細(xì)胞貼壁生長良好

2.2 激光共聚焦顯微鏡觀察

可注射型生物蛋白膠載體活細(xì)胞澆鑄后,絕大部分細(xì)胞 FDA染色呈綠色熒光;只有極少量的細(xì)胞PI染色陽性,細(xì)胞呈紅色熒光。

載體聚合 1 d后,部分細(xì)胞呈成纖維狀;載體聚合 3 d后,大部分細(xì)胞呈成纖維狀細(xì)胞生長。在 0～5000μm的層切深度中,每隔 5～6層切面觀察,絕大部分細(xì)胞 FDA染色陽性,呈綠色熒光,細(xì)胞形態(tài)基本正常 (圖 2)。

2.3 BrdU免疫組化

細(xì)胞 BrdU標(biāo)記后,冰凍切片免疫組織化學(xué)染色觀察,部分細(xì)胞核 DAB染色陽性;冰凍切片見生物蛋白膠內(nèi)部成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),孔徑大小不一 (圖3)。

3 討論

體外構(gòu)建工程化組織時需要最大程度地利用細(xì)胞資源,盡可能縮短制備時間。目前,主要的方法是利用細(xì)胞貼壁生長的特性,將細(xì)胞懸液注入材料的孔隙,孵育后使細(xì)胞貼附于材料表面。由于重力作用和長時間孵育引起的部分細(xì)胞受損而不能與支架材料黏附緊密,不僅造成種子細(xì)胞的浪費,而且附著不均勻,單純提高接種細(xì)胞數(shù)量難以增加黏附細(xì)胞數(shù)量。有學(xué)者探討利用三維立體培養(yǎng),使種子細(xì)胞最大限度地貼附在支架材料上[4,5],一定程度上可以增加種子細(xì)胞的數(shù)量,但存在操作復(fù)雜、耗時,且種子細(xì)胞僅能貼附在支架表面等實際困難。

生物蛋白膠因在一定條件下能夠在液態(tài)和固態(tài)之間轉(zhuǎn)化的特點,可以在液態(tài)時將其與種子細(xì)胞充分混合,注射后聚合固化,并且聚合后細(xì)胞可被均勻包埋在固態(tài)的纖維蛋白網(wǎng)內(nèi),實現(xiàn)體內(nèi)的組織工程化,減少了種子細(xì)胞的丟失。同時三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)提供了較大的接觸面積和細(xì)胞生理活性面積,可以很好地存活、增殖。生物蛋白膠體具有良好的生物相容性、生物降解性、可塑性及止血功能等多種優(yōu)點,可以作為注射型載體很好地應(yīng)用到微創(chuàng)外科領(lǐng)域。本實驗結(jié)果表明骨髓基質(zhì)細(xì)胞包埋于生物蛋白膠內(nèi)能很好地存活,第 2天細(xì)胞伸出偽足,呈典型的成纖維細(xì)胞形態(tài);6 d后生物蛋白膠邊緣部分開始降解,細(xì)胞脫落至培養(yǎng)板;體外培養(yǎng) 14 d,細(xì)胞生長良好,大部分生物膠降解,脫落的細(xì)胞增多,貼壁生長的細(xì)胞形態(tài)正常;3周后生物蛋白膠完全降解。

圖 2 活細(xì)胞包埋 3 d,FDA-PI雙染,生物蛋白膠不同層面的 Confocal觀察結(jié)果,細(xì)胞存活良好,FDA染色陽性(綠色熒光),幾乎未見 PI染色陽性(紅色熒光)的死細(xì)胞

圖 3 BrdU標(biāo)記后網(wǎng)狀生物蛋白膠內(nèi)可見 BrdU陽性的增殖細(xì)胞,冰凍切片免疫組化染色 ×200

FDA染料只有活細(xì)胞才能著色,熒光顯微鏡下呈綠色熒光;而碘化丙啶 (propidium iodine,PI)在嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光,盡管 PI不能通過活細(xì)胞膜,但卻能穿過破損的細(xì)胞膜而對核染色,熒光顯微鏡下呈紅色熒光。FDA-PI熒光雙染法能同時對活細(xì)胞和死細(xì)胞染色,用于檢測細(xì)胞存活率。激光共聚焦顯微鏡可以有效地觀察到細(xì)胞內(nèi)部與載體內(nèi)部的形態(tài)學(xué)變化,我們利用激光共聚焦顯微鏡的層切功能觀察到距離載體表面 5000μm深度的細(xì)胞仍然存活良好,分布較均勻,細(xì)胞形態(tài)正常,很少能看到 PI染色陽性的細(xì)胞。

由于生物蛋白膠是多空隙三維結(jié)構(gòu),能保證營養(yǎng)物質(zhì)和代謝產(chǎn)物進出支架內(nèi)外,本實驗將可注射型生物蛋白膠聚合后包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞體外培養(yǎng)時,通過倒置相差顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡等觀察,證實骨髓基質(zhì)細(xì)胞在生物蛋白膠中能夠很好地吸取營養(yǎng)并生長。生物蛋白膠聚合后包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞于三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)中培養(yǎng),細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)大于普通貼壁細(xì)胞,因此,培養(yǎng)液也消耗較快。

當(dāng)細(xì)胞DNA合成時,BrdU能夠作為核苷酸的前體取代胸腺嘧啶核苷被摻入到新合成的 DNA中。在第一個細(xì)胞周期時,由于半保留復(fù)制的機制,中期染色體的每條染色單體 DNA雙鏈都被摻入 BrdU。本實驗結(jié)果顯示生物膠內(nèi)包埋的細(xì)胞能夠增殖,Brdu染色陽性。

臨床治療組織缺損時,常需要不同形狀和規(guī)格的材料,如能解決材料的可塑性問題,將為臨床提供極大的方便。生物蛋白膠在這方面具有自己獨特的優(yōu)勢。生物蛋白膠可以任意塑型并具有一定的黏彈性,具有很好的可塑性。另外,由于生物蛋白膠特殊的理化特性,還可以作為藥物、細(xì)胞因子的緩釋載體,以更好地促進工程化組織在體內(nèi)的轉(zhuǎn)歸。利用生物蛋白膠作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白 (bone morphogenic protein,BMP)可以促進骨缺損的修復(fù)[6],有研究表明生物蛋白膠包埋骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植后可以促進骨缺損的修復(fù)[7,8]。在實際應(yīng)用中還可作為 BMP或其他細(xì)胞因子的緩釋載體復(fù)合種子細(xì)胞將更有效地促進骨缺損的修復(fù)。我們同樣利用生物蛋白膠復(fù)合BMP-2,CT引導(dǎo)下在猴椎體前、側(cè)緣采用微創(chuàng)方法穿刺注射后可以很好地成骨,促進椎體融合 (結(jié)果另外報道)。

生物蛋白膠在纖溶酶作用下能夠完全降解吸收,一般 3～4周可以完全降解吸收,降解時間與局部的纖溶活性等微環(huán)境及載體厚度有關(guān)。有在生物蛋白膠制備時加入纖溶酶抑制劑如抑肽酶等,能使生物蛋白膠更牢固更持久[9]。如能改善生物蛋白膠的降解速度和力學(xué)性能,或聯(lián)合其它材料用作組織工程支架材料,將會發(fā)揮更大的作用。

總之,生物蛋白膠是一種理想的適用于微創(chuàng)操作的可注射的組織工程培養(yǎng)和移植的支架。

1 龐廣興,陳建庭,鐘招明,等.椎體內(nèi)注射醫(yī)用生物蛋白膠對松質(zhì)骨創(chuàng)面出血影響的實驗研究.中國脊柱脊髓雜志,2009,(5):372-375.

2 喻 磊,谷天祥,姜春力,等.醫(yī)用生物蛋白膠在骨質(zhì)疏松患者冠狀動脈搭橋手術(shù)中的應(yīng)用.中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2007,36(1):84-85.

3 楊景山.活細(xì)胞的檢測.見:楊景山,主編.醫(yī)學(xué)細(xì)胞化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)技術(shù).北京:北京醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社,1990.118-121.

4 呂昌偉,胡蘊玉,白建萍,等.轉(zhuǎn)壁反應(yīng)器三維立體培養(yǎng)多樣本骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞實驗研究.中國骨與關(guān)節(jié)損傷雜志,2008,23(7):561-563.

5 何清義,李 強,羅 飛,等.三維立體培養(yǎng)法誘導(dǎo)去分化軟骨細(xì)胞Ⅱ型膠原的重新表達.中華實驗外科雜志,2007,24(3):307-309.

6 Han DK,Kim CS,Jung UW,et al.Effect of a fibrin-fibronectin sealing system as a carrier for recombinant human bonemorphogenetic protein-4 on bone for mation in rat calvarial defects.J Periodontol,2005,76(12):2216-2222.

7 LeongDT,NahWK,Gupta A,et al.The osteogenic differentiation of adipose tissue-derived precursor cells in a 3D scaffold/matrix environment.CurrDrugDiscov Technol,2008,5(4):319-327.

8 LeeOK,CoathupMJ,Goodship AE,et al.Use ofmesenchymal stem cells to facilitate bone regeneration in normal and chemotherapytreated rats.Tissue Engl,2005,11(11-12):1727-1735.

9 Fussenegger M,MeinhartJ,H?bling W,etal.Stabilized autologous fibrin chondrocyte constructs for cartilage repair in vivo.Ann Plast Surg,2003,51(5):493-498.

(修回日期:2010-04-29)

(責(zé)任編輯:李賀瓊)

Tissue-Engineered Bone Marrow Stromal Cells Embedded with I njectable Fibr in Glue in Vitro

Wang Jingying,Song Quansheng,Zhu Jinglin,et al.Depar tm ent of O rthopedics,Peking University Third Hospital,Beijing100191,China

ObjectiveTo construct tissue-engineered graft with bone marrow stromal cells(BMSCs)imbedded in the polymerized fibrin biopolymer scaffoldin vitro,observe its biological characteristics and degradationin vitro,and explore the biological basis of using injectable fibrin glue as a scaffold in tissue engineering by minimal invasive surgery.MethodsBMSCs embedded with injectable fibrin glue were polymerized and culturedin vitro. Its biological characteristics,including gel for mation,cell growth,histological features,and degeneration time of the fibrin glue were observed under an inverted phase contrast microscope and laser confocalmicroscope.5-Bromodeocyuridine(Brdu)incorporation,frozen section and immunohistochemical staining were employed to study the growth and proliferation of the BMSCs,and the degradation of the fibrin glue.ResultsThe BMSCs embedded in the fibrin glue grew well,homogeneously distributed in the polymerized fibrin glue.Brdu incorporation and immunohistochemical staining showed that the BMSCs embedded in the fibrin glue could also proliferate well.Two days after the embedment,the cellswith typical fibroblastshaped morphology could be observed.The edge of the fibrin glue began to degrade six days later and the cells fell off to the culture template.After fourteen days,most of the fibrin glue degraded and the adherent cells grew well.The polymerized fibrin glue degraded completely after 3 weeks.ConclusionsSeeding cells embedded in polymerized fibrin glue can grow and proliferate well.Fibrin glue is an ideal injectable scaffold for embeddingBMSCs for culture and transplantation bymin imally invasive surgerymethod.

Biological fibrin glue; Bone marrow stromal cells; Tissue engineering; Scaffold

R34

A < class="emphasis_bold">文章編號:1

1009-6604(2010)06-0560-05

2010-03-11)

＊國家自然科學(xué)基金資助項目(30300352,30772200)

＊＊ 通訊作者,E-mail:schl@bjmu.edu.cn

① 中心實驗室