博落回中生物堿對(duì)5種皮癬真菌抑制作用的初步研究

田 晶， 郁建平， 葛永輝， 齊柳婭， 李春梅

(貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽(yáng)550025)

紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)，許蘭黃癬菌(Trichophyton schoenleini)，玫瑰色癬菌(Trichophyton rosaceum)，須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)，絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)是人源的皮膚癬菌，能引起常見(jiàn)的皮膚淺部真菌，如手癬、足癬、頭癬等。目前常見(jiàn)的治療皮膚真菌的主要有酮康唑，伊曲康唑等化學(xué)用藥，雖然在抑制皮癬真菌有一定的作用，但對(duì)于真菌病卻不能起到很好的根治作用。因此，篩選植物中有抗真菌活性的成分，具有一定的研究意義。博落回(Macleaya Cordata(Willd)R.Br)是罌粟科博落回屬(Macleaya R.Br)植物，研究表明，博落回中含有豐富的生物堿并具有重要的藥理活性［1，2］。目前對(duì)于博落回的研究主要集中在提取純化工藝以及藥理作用方面，在農(nóng)藥以及獸藥方面有一定的應(yīng)用［3］。民間有以博落回全草入藥，主治惡瘡及皮膚?。?］。本研究對(duì)博落回生物堿的抗皮癬真菌活性進(jìn)行測(cè)定，目的在于對(duì)開(kāi)發(fā)博落回應(yīng)用于皮膚用藥方面提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)供試菌種 紅色毛癬菌(Trichophyton rubrum)、許蘭黃癬菌(Trichophyton schoenleini)、玫瑰色癬菌(Trichophyton rosaceum)、須癬毛癬菌(Trichophyton mentagrophytes)、絮狀表皮癬菌(Epidermophyton floccosum)均購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 博落回生物堿，自制，含量約為70%，鹽酸血根堿純品(sigma公司)，白屈菜堿純品(sigma公司)，復(fù)方酮康唑軟膏(7 g):(批號(hào):090321，廣東順?lè)逅帢I(yè)有限公司)。

2 方法

2.1 博落回生物堿的制備 取博落回全草，粉碎，室溫下用0.5% 鹽酸滲漉，合并滲漉液，調(diào)節(jié)pH約為3，通過(guò)預(yù)先處理好的強(qiáng)酸型陽(yáng)離子樹(shù)脂，上柱，洗脫，濃縮，得到博落回生物堿，樣品為淡黃色粉末，生物堿含量約為70%。

2.2 培養(yǎng)基的制備 采用沙氏培養(yǎng)基:蛋白胨10 g，瓊脂 20 g，葡萄糖 40 g，蒸餾水 1 000 mL，121 ℃滅菌30 min，未調(diào)pH。其它:水瓊脂:瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL;0.1% 吐溫-80生理鹽水。

2.3 待測(cè)物的配置 抑菌試驗(yàn)配置50 mg/mL的博落回生物堿溶液，10 mg/mL的血根堿鹽酸鹽溶液以及10 mg/mL的白屈菜堿溶液。抑制率實(shí)驗(yàn)將博落回生物堿配制成 20、10、5、4、3 mg/mL 的溶液各25 mL。最低抑菌濃度實(shí)驗(yàn)將博落回生物堿配制成48、24、12、6、3 mg/mL 的溶液各 10 mL。溶劑為40%二甲基甲酰胺溶液。

2.4 菌懸液的制備 將試管斜面的菌種接種于平板中，28～30℃培養(yǎng)7 d，活化菌種。將已活化的菌種接種于試管斜面內(nèi)，28～30℃培養(yǎng)7 d。用0.1%吐溫生理鹽水洗孢子，調(diào)節(jié)孢子懸液在低倍鏡下(15×10倍)下每視野80～100個(gè)左右孢子。

2.5 抑菌實(shí)驗(yàn) 制備雙層培養(yǎng)基，采用瓊脂打孔法［5］。將已滅菌的水瓊脂10 mL熔化后趁熱倒入9 cm直徑的培養(yǎng)皿中。待水瓊脂凝固后，將已融化的10 mL沙氏培養(yǎng)基冷至約50℃左右，迅速吸取1 mL菌液加入培養(yǎng)基內(nèi)，充分混勻后，倒入已凝固的水瓊脂上。每種菌液各制作3個(gè)含菌瓊脂平板，待充分凝固后，用滅菌的打孔器在每個(gè)瓊脂平板上打3個(gè)孔，第一種瓊脂平板中的孔中分別加入40μL博落回生物堿溶液、陽(yáng)性藥液、空白溶液;第二種中加入鹽酸血根堿溶液、陽(yáng)性藥液、空白溶液;第三種中加入白屈菜堿溶液、陽(yáng)性藥液、空白溶液，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。重復(fù)4次，測(cè)量抑菌圈。

2.6 抑制率測(cè)定 平板稀釋法［5］，將已經(jīng)配制好的博落回生物堿溶液，濃度分別為 20、10、5、4、3 mg/mL，各吸取2 mL于滅菌的三角瓶中，加入13 mL滅菌后并冷卻至50℃左右的培養(yǎng)基，立即搖勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)凝固。最終培養(yǎng)基內(nèi)的博落回生物堿溶液的濃度分別為 2.67、1.33、0.67、0.53、0.4 mg/mL。另外，吸取2 mL 40% 二甲基甲酰胺溶液置于已滅菌的三角瓶中，加入13 mL滅菌并冷卻的培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中做空白對(duì)照。用打孔器分別在5種供試菌中生長(zhǎng)旺盛的菌落邊緣打取直徑為0.5 cm的菌圓片，移至含藥液的瓊脂平板中央，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周。重復(fù)4次。7 d后觀察菌落直徑，取平均值，計(jì)算平均抑菌率。按下式計(jì)算抑菌率:菌落直徑(mm)=測(cè)量菌落直徑－5(mm)，抑菌率(%)=(對(duì)照菌落直徑－處理菌落直徑)/對(duì)照菌落直徑×100%。

2.7 最低抑菌濃度(MIC)值的測(cè)定 固體培養(yǎng)基稀釋法［5］，將48 mg/mL的博落回生物堿溶液用滅菌蒸餾水分別稀釋成 24、12、6、3 mg/mL的藥液。分別取每種濃度的藥液1 mL，加入14 mL滅菌并冷卻至60℃的沙氏培養(yǎng)基，立即搖勻倒入培養(yǎng)皿內(nèi)凝固。博落回生物堿的終濃度分別為3.2、1.6、0.8、0.4、0.2 mg/mL。另外，吸取1 mL 40% 二甲基甲酰胺溶液，加入14 mL滅菌并冷卻的培養(yǎng)基，倒入培養(yǎng)皿中做空白對(duì)照。用接種環(huán)蘸取供試菌液在已凝固好的培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線培養(yǎng)，置28℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d。重復(fù)4次，觀察結(jié)果。

3 結(jié)果

3.1 博落回生物堿、血根堿、白屈菜堿抑菌比較結(jié)果顯示:血根堿對(duì)除了對(duì)須癬毛癬菌無(wú)抑制作用，對(duì)紅色毛癬菌的抑制作用相對(duì)較差外，對(duì)許蘭黃癬菌、玫瑰色癬菌、絮狀表皮癬菌，均有良好的抑制效果，其中尤其對(duì)玫瑰色癬菌的抑制效果明顯。白屈菜堿對(duì)紅色毛癬菌以及玫瑰色癬菌無(wú)明顯抑制作用，對(duì)許蘭黃癬菌、絮狀表皮癬菌、須癬毛癬菌均有一定的抑制作用，且效力相當(dāng)。博落回總生物堿對(duì)于5種皮癬真菌均有抑菌效果。具體結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 博落回生物堿，血根堿鹽酸鹽，白屈菜堿對(duì)5種皮膚癬菌抑菌效果(抑菌圈直徑:mm，±s，n=4)Tab.1 The anti-fungus activaties of the compounds from Macleaya cordata

表1 博落回生物堿，血根堿鹽酸鹽，白屈菜堿對(duì)5種皮膚癬菌抑菌效果(抑菌圈直徑:mm，±s，n=4)Tab.1 The anti-fungus activaties of the compounds from Macleaya cordata

注:Tru:紅色毛癬菌，Ts:許蘭黃癬菌，Tro:玫瑰色癬菌，Ep:絮狀表皮癬菌，Tm:須癬毛癬菌。/表示無(wú)明顯的抑菌圈。

待測(cè)物 試驗(yàn)菌種Tru Ts Tro Ep Tm博落回生物堿12±2.4 9±1.4 25±1.6 18±2.2 15±1.4血根堿 5±0.8 13±0.8 30±2.7 15±1.6 /白屈菜堿 / 18±1.4 / 11±1.8 10±0.8復(fù)方酮康唑10±1.4 11±2.2 23±2.8 20±1.6 13±1.8

3.2 不同濃度博落回生物堿對(duì)5種皮癬真菌生長(zhǎng)的抑制作用比較 結(jié)果顯示:在博落回生物堿濃度分別為2.67mg/mL及1.33mg/mL時(shí)，對(duì)紅色毛癬菌、許蘭黃癬菌、絮狀表皮癬菌、玫瑰色癬菌、須癬毛癬菌的抑制率均達(dá)到100%，抑菌效果顯著。當(dāng)濃度為0.67 mg/mL時(shí)，博落回生物堿對(duì)這5種生物堿的抑制率均在70%以上，對(duì)玫瑰色癬菌的抑制率達(dá)到90%以上。但在濃度為0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)于絮狀表皮癬菌的抑制率低于30%，相對(duì)其它真菌的抑制率而言，其抑菌效果較差。具體結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 博落回生物堿對(duì)5種真菌的抑制率(±s，n=4)Tab.2 The inhibition rate of 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

表2 博落回生物堿對(duì)5種真菌的抑制率(±s，n=4)Tab.2 The inhibition rate of 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

注:表內(nèi)數(shù)字為抑制率(%)，—表示沒(méi)有真菌生長(zhǎng)，抑制率為100%。

供試菌種博落回生物堿2.67 mg/mL 1.33 mg/mL 0.67 mg/mL 0.53 mg/mL 0.4 mg/mL Tru— —70.6±1.4 64.7±3.4 62.4±1.9 Ts — — 71.0±2.5 64.5±2.0 58.1±1.5 Ep — — 72.2±2.9 44.4±2.3 27.8±1.4 Tro — — 91.1±1.9 78.1±3.4 75.0±3.4 Tm— —86.7±3.1 83.3±2.3 76.7±2.8

3.3 博落回生物堿的最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定結(jié)果顯示:博落回生物總堿對(duì)紅色毛癬菌、許蘭黃癬菌以及絮狀表皮癬菌的最低抑菌濃度均為1.6 mg/mL，對(duì)玫瑰色癬菌、須癬毛癬菌的最低抑菌濃度為0.8 mg/mL。由結(jié)果可知，博落回生物堿作為植物源天然抗真菌劑，效果明顯。空白組的結(jié)果為真菌大量生長(zhǎng)，說(shuō)明博落回生物堿的的抗菌活性較好。具體結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 博落回生物堿最低抑菌濃度(M IC)值(x=Σxi/n，n=4)Tab.3 The M IC test for 5 kinds of skin fungus by M acleaya alkaloids

4 討論

研究結(jié)果表明，博落回生物堿具有顯著的抑制皮癬真菌的作用，而博落回生物堿中的血根堿和白屈菜堿雖然也有一定的抑制皮癬真菌的作用，但其總體效果不及博落回生物堿。博落回在全國(guó)廣泛分布，資源容易獲得，其所含的生物堿也較容易提取。民間已將博落回酊劑用來(lái)治療手足癬。我們可以利用博落回豐富的資源，針對(duì)其對(duì)皮癬真菌良好的活性，將博落回生物堿開(kāi)發(fā)利用為治療皮膚病的劑型，這將具有廣闊的市場(chǎng)前景和意義。

［1］胡之壁，徐 垠，馮勝初，等.博落回果實(shí)中有效成分的研究［J］. 藥學(xué)學(xué)報(bào)，1979，14(9):53.

［2］高尾樽雄，安本幸.罌粟科植物博落回生物堿的研究［J］.藥學(xué)雜志(日)，1973，93:242.

［3］周順玉.博落回浸提物對(duì)茶毛蟲(chóng)、茶尺蠖的生物活性［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2007，35(5):1408.

［4］宋有林.博落回酊劑治療手足股癬30例［J］.中醫(yī)外治雜志，2000，5:41.

［5］周立剛.植物抗菌化合物［M］.北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科技出版社，第一版，2005:10.

［6］鄭鈞鏞.藥品微生物學(xué)及檢測(cè)技術(shù)［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1989.