氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠腦細(xì)胞凋亡的影響

饒子亮，倪 錦，鐘志勇，孫 俠，鐘海潮，王 剛，陳系古

(1.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248;2.廣州市兒童醫(yī)院，廣州 510120)

氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠腦細(xì)胞凋亡的影響

饒子亮1，倪 錦2，鐘志勇1，孫 俠1，鐘海潮1，王 剛1，陳系古1

(1.廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，佛山 528248;2.廣州市兒童醫(yī)院，廣州 510120)

目的 探討臨床上常用的麻醉劑氯胺酮對(duì)乳鼠腦細(xì)胞凋亡的影響。方法 新生7日齡SD大鼠15只，隨機(jī)分成3組:氯胺酮低劑量組、高劑量組分別腹腔注射20 mg/kg、80 mg/kg氯胺酮，對(duì)照組給予等量的生理鹽水。麻醉后24 h，取腦組織作HE染色，用TUNEL法檢測(cè)腦細(xì)胞的凋亡情況，用免疫組織化學(xué)法檢測(cè) Caspase－3的表達(dá)水平。結(jié)果 與對(duì)照組比較，氯胺酮低劑量組的凋亡細(xì)胞增多但不明顯(P＞0.05)，神經(jīng)元核固縮和Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P＜0.05);氯胺酮高劑量組的凋亡細(xì)胞數(shù)、神經(jīng)元核固縮及Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著性增加(P＜0.05)。神經(jīng)元核固縮、凋亡細(xì)胞和Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞均以皮層區(qū)多見(jiàn)。結(jié)論 80 mg/kg氯胺酮可引起乳鼠腦細(xì)胞凋亡，以皮層區(qū)為主，Caspase－3的激活可能是其作用機(jī)制之一;20 mg/kg氯胺酮對(duì)乳鼠腦細(xì)胞凋亡的影響較輕微，其臨床等效劑量為3 mg/kg。氯胺酮小兒麻醉用量不宜過(guò)多，避免引起腦細(xì)胞的凋亡。

氯胺酮;乳鼠;腦細(xì)胞凋亡;Caspase－3;皮層區(qū)

氯胺酮于1965年由 Domino用于臨床［1］，在麻醉藥中一直享有獨(dú)特的地位，近年來(lái)在小兒臨床麻醉中已被列為最常用的基本藥物之一，廣泛用于兒童患者的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛。其在小兒臨床麻醉中隨著對(duì)其作用機(jī)制、氯胺酮的特點(diǎn)及先發(fā)止痛和對(duì)神經(jīng)元影響的深入認(rèn)識(shí)，臨床上有一種重新評(píng)價(jià)氯胺酮的趨勢(shì)。許多研究指出，氯胺酮用于術(shù)后鎮(zhèn)痛常出現(xiàn)精神癥狀等副作用，且與劑量有關(guān)［2］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已證明，注射常用劑量氯胺酮后24 h，SD幼鼠神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡，突觸素表達(dá)減少可能和氯胺酮神經(jīng)毒性有關(guān)［3］。在臨床上應(yīng)用時(shí)，氯胺酮的副作用尤其是其具有與劑量成正相關(guān)性的精神方面副作用如幻覺(jué)、視覺(jué)模糊、嗜睡等不容忽視，故研究氯胺酮的用量與其副作用的發(fā)生、在未成熟神經(jīng)系統(tǒng)的主要作用部位，在小兒麻醉方面具有一定的科學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件:SPF級(jí)新生7日齡SD乳鼠15只，體重12～15 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SCXK(粵)2008－0002;合格證號(hào):2008A020］。

SPF級(jí)SD大鼠飼養(yǎng)在廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)環(huán)境設(shè)施合格證號(hào):SYXK(粵)2008－0002，室內(nèi)保持 20℃～25℃，濕度40%～70%，自由飲水、進(jìn)食，水料充足，SPF級(jí)飼料產(chǎn)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.2 主要試劑和儀器:鹽酸氯胺酮注射液(2mL:0.1g)，由廣州市兒童醫(yī)院提供，批號(hào):KH080601。多聚甲醛為天津市福晨化學(xué)試劑廠產(chǎn)品，批號(hào):20080112;TUNEL原位凋亡檢測(cè)試劑盒為Roche公司產(chǎn)品，批號(hào):1449220;多克隆兔抗半胱天冬酶－3(Caspase－3)抗體為英國(guó) abcam公司產(chǎn)品，批號(hào):20080130;免疫組化SP試劑盒由北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司提供，批號(hào):K86815B。BX41熒光成像系統(tǒng)顯微鏡為奧林巴斯生產(chǎn);Iamge－Pro Puls6.0多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)(版本6.0)為MediaCybernetics，Inc.開(kāi)發(fā);YP3001N電子天平由上海精密科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)，精度:0.1 g;PM－8000 Express便攜式多參數(shù)監(jiān)護(hù)儀由深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:15只SD大鼠隨機(jī)分成3組(n=5):對(duì)照組:腹腔注射10mL/kg生理鹽水;氯胺酮低劑量組:腹腔注射20 mg/kg氯胺酮;氯胺酮高劑量組:腹腔注射80 mg/kg氯胺酮。將乳鼠翻正反射消失作為麻醉成功的標(biāo)準(zhǔn)，每組動(dòng)物腹腔注射給藥一次。麻醉后均仔細(xì)觀察乳鼠的皮膚顏色，有無(wú)缺氧表現(xiàn)。將麻醉后動(dòng)物放在30%的氧氣環(huán)境中，麻醉期間用嬰兒脈搏血氧飽和度探頭貼于乳鼠腹部，應(yīng)用監(jiān)護(hù)儀監(jiān)測(cè) SpO2(血氧飽和度)和 HR(心率)，直到動(dòng)物翻正反射恢復(fù)。麻醉清醒后，返回母鼠身邊繼續(xù)喂養(yǎng)。

1.2.2 組織病理學(xué)檢測(cè):麻醉24 h后斷頭處死，取腦組織，在多聚甲醛/PBS溶液中固定24 h后，常規(guī)石蠟切片，基本過(guò)程是:組織取材→固定→沖洗→脫水→透明→浸蠟→組織包埋→組織切片→展片附貼→切片脫蠟→染色→染色透明→封固。

1.2.3 Caspase－3免疫組織化學(xué)檢測(cè):按免疫組化二步法進(jìn)行Caspase－3免疫組織化學(xué)染色，主要實(shí)驗(yàn)流程為:(1)切片常規(guī)脫蠟至水:用二甲苯浸洗2次，每次 15 min，用梯度乙醇(100%×5 min、100%×5 min、95%×3 min、85%×3 min、75%×2 min)，用蒸餾水浸洗2 min;(2)抗原修復(fù):0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)微波修復(fù)，微波爐內(nèi)以中高火修復(fù)5 min，靜置10 min，重新修復(fù)5 min，再靜置10 min，自然涼至室溫;(3)浸入3%H2O210 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次;(4)滴加適當(dāng)稀釋的Caspase－3兔一抗，4℃過(guò)夜，PBS沖洗 3次，每次5 min;(5)滴加二抗(山羊抗兔 IgG抗體－HRP)，37℃ 25 min，PBS沖洗 3次，每次 5 min;(6)DAB顯色:使用二氨基聯(lián)苯氨(DAB)室溫顯色，鏡下控制反應(yīng)時(shí)間，一般在5～30 min之間，自來(lái)水沖洗;(7)蘇木素輕度復(fù)染30 s，自來(lái)水沖洗;(8)梯度酒精脫水(75%、85%、95%各 30 s，100%、100%各1 min)、二甲苯透明5 min，中性樹(shù)脂封片。以細(xì)胞漿呈棕黃色顆粒等形態(tài)學(xué)特征判斷為陽(yáng)性細(xì)胞，應(yīng)用Iamge－Pro Puls6.0多功能彩色病理圖像分析系統(tǒng)，在10×40倍高倍顯微鏡下，計(jì)數(shù)0.12mm2皮層區(qū)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 TUNEL法檢測(cè)凋亡:按原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。主要為:(1)切片常規(guī)脫蠟至水;(2)浸入3%H2O210 min阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，PBS沖洗3次;(3)抗原修復(fù):0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液(pH6.0)微波修復(fù)，微波爐內(nèi)以中高火修復(fù)5 min，靜置10 min，自然涼至室溫;(4)加5%BSA封閉液室溫30 min(5)100 μL試劑2(Label Solution)和 50 μL 試劑 1(Enzyme Solution)混勻;(6)去除封閉液，陰性對(duì)照滴入50μL試劑2，陽(yáng)性對(duì)照和其他片加50 μL混合液，蓋上封口膜，37℃孵育60 min，PBS洗5 min×3次;(7)加 50 μL試劑 3(Converter－POD)，蓋上封口膜，37℃ 孵育 30 min。PBS洗4 min，重復(fù)洗3次。加入1滴DAB顯色液，2～10 min，鏡下觀察最佳作用時(shí)間;(8)蒸餾水沖洗，蘇木素復(fù)染，水沖洗。梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封片。以細(xì)胞核呈棕黃色并結(jié)合胞體縮小等形態(tài)學(xué)特征判斷為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，檢測(cè)腦組織的細(xì)胞凋亡情況。照相并隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野(×400)，分別計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)和陽(yáng)性凋亡細(xì)胞，計(jì)算出凋亡指數(shù)(apoptosis index，AI)。AI(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理:所有數(shù)據(jù)均運(yùn)用SPSS11.0進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，各組計(jì)算數(shù)據(jù)均采用(±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠一般表現(xiàn)的影響

在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，所有乳鼠呼吸平穩(wěn)，氯胺酮低劑量組和高劑量組乳鼠皮膚顏色與對(duì)照組一樣均呈粉紅色，未發(fā)現(xiàn)有缺氧情況。實(shí)驗(yàn)中，氯胺酮高劑量組麻醉起效時(shí)間短，而氯胺酮低劑量組麻醉起效時(shí)間長(zhǎng)。麻醉恢復(fù)后，實(shí)驗(yàn)組乳鼠均能正常覓食，未見(jiàn)神經(jīng)系統(tǒng)受損表現(xiàn)。

2.2 氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠SpO2(血氧飽和度)與HR(心率)的影響

對(duì)照組、氯胺酮低劑量組、氯胺酮高劑量組的SpO2基本能維持在90%以上。與對(duì)照組比較，氯胺酮低劑量組和氯胺酮高劑量組的HR都明顯升高。

2.3 氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠腦組織病理學(xué)的影響

對(duì)照組可見(jiàn)少量神經(jīng)元核固縮(圖1);氯胺酮低劑量組、氯胺酮高劑量組皮層區(qū)均可見(jiàn)較多神經(jīng)元核固縮(比對(duì)照組明顯增多)(圖2、3)，海馬區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)元核固縮。

2.4 氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠腦細(xì)胞凋亡的影響

凋亡細(xì)胞在光鏡下可見(jiàn)體積縮小，細(xì)胞核固縮呈棕褐色染色，并可見(jiàn)細(xì)胞皺縮、細(xì)胞碎裂。對(duì)照組、氯胺酮低劑量組僅見(jiàn)散在的凋亡細(xì)胞(圖4、5);氯胺酮高劑量組皮層區(qū)可見(jiàn)較多染色質(zhì)濃縮、呈棕黃色、圓形或卵圓形的凋亡細(xì)胞(圖6)，氯胺酮高劑量組海馬區(qū)僅見(jiàn)散在的凋亡細(xì)胞。表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，氯胺酮高劑量組皮層區(qū)細(xì)胞凋亡率顯著升高(P＜0.05)，氯胺酮低劑量組皮層區(qū)細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)，但有升高的趨勢(shì)。與對(duì)照組比較，氯胺酮低劑量組和氯胺酮高劑量組海馬區(qū)細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

2.5 氯胺酮麻醉對(duì)乳鼠腦Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞的影響

免疫組化結(jié)果顯示，對(duì)照組皮層區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)元Caspase－3弱表達(dá)(圖7)，氯胺酮低劑量組、高劑量組皮層區(qū)可見(jiàn)較多神經(jīng)元 Caspase－3中等程度表達(dá)(圖8、9)。對(duì)照組、氯胺酮低劑量組、氯胺酮高劑量組海馬區(qū)可見(jiàn)少量神經(jīng)元 Caspase－3弱表達(dá)。表1結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，氯胺酮低劑量組和氯胺酮高劑量組皮層區(qū)Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)顯著升高(P＜0.05);與對(duì)照組比較，氯胺酮低劑量組和氯胺酮高劑量組海馬區(qū)Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。

表1 乳鼠腦Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞凋亡結(jié)果Tab.1 Neonatal rat brain Caspase－3 positive cells and nerve cell apoptosis results

3 討論

NMDA受體(N－甲基－D－天冬氨酸受體)對(duì)發(fā)育中大腦有營(yíng)養(yǎng)作用，促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的增殖、分化、遷移能力。Ikononmidou 等［4，5］發(fā)現(xiàn)，出生 14 d 內(nèi)的新生大鼠，使用 NMDA受體拮抗劑(MK－801、苯環(huán)己哌啶或乙醇)后能引起廣泛的神經(jīng)細(xì)胞凋亡變性，成年大鼠用藥后卻沒(méi)有出現(xiàn)凋亡，這說(shuō)明在大鼠腦發(fā)育高峰期(出生前1 d至出生后14 d)，使用NMDA受體拮抗劑會(huì)干擾中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育。

目前NMDA受體拮抗劑在小兒麻醉中應(yīng)用廣泛，它們對(duì)發(fā)育期神經(jīng)系統(tǒng)的影響尚未引起麻醉醫(yī)生的重視。本實(shí)驗(yàn)選用的氯胺酮是一種非選擇性NMDA受體拮抗劑，常用于嬰幼兒麻醉。實(shí)驗(yàn)所用的氯胺酮低劑量為20 mg/kg，是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［5］和預(yù)實(shí)驗(yàn)所確定的能產(chǎn)生鼠類(lèi)麻醉狀態(tài)的最低有效劑量(以翻正反射消失作為產(chǎn)生麻醉狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn));氯胺酮高劑量為80 mg/kg，是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［6］和預(yù)實(shí)驗(yàn)所確定的維持SpO2和HR在正常值范圍的最高劑量。有證據(jù)表明［7］，細(xì)胞凋亡的某些特征性標(biāo)志，如染色體凝聚和 DNA片段化等，均與Caspase－3有著直接的關(guān)系。選用Caspase－3作為檢測(cè)指標(biāo)，既能明確凋亡的存在，又闡明了凋亡發(fā)生的可能機(jī)制。

本研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮一次性注射乳鼠后24 h未觀察出明顯的神經(jīng)功能損壞，但從腦組織HE染色、TUNEL檢測(cè)、免疫組化結(jié)果可見(jiàn)，對(duì)照組、氯胺酮低劑量組僅見(jiàn)散在的凋亡細(xì)胞，但氯胺酮低劑量組可見(jiàn)較多神經(jīng)元核固縮和較多神經(jīng)元 Caspase－3中等程度表達(dá);氯胺酮高劑量組皮層區(qū)可見(jiàn)較多染色質(zhì)濃縮的呈棕黃色的圓形或卵圓形的凋亡細(xì)胞、較多神經(jīng)元核固縮、較多神經(jīng)元 Caspase－3中等程度表達(dá)，與對(duì)照組比較有顯著性差異。這提示Caspase－3的激活可能是氯胺酮導(dǎo)致腦細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，氯胺酮引起乳鼠腦細(xì)胞凋亡依從劑量－效應(yīng)關(guān)系，使用高劑量氯胺酮才會(huì)引起明顯的腦細(xì)胞凋亡，低劑量氯胺酮對(duì)乳鼠腦細(xì)胞凋亡影響較高劑量組輕微。氯胺酮臨床小兒麻醉劑量為(4～5)mg/kg，必要時(shí)追加1/2量，換成大鼠等效劑量為(26～32.5)mg/kg，追加劑量為(12～16.25)mg/kg，有誘導(dǎo)小兒腦細(xì)胞凋亡的風(fēng)險(xiǎn)。小兒麻醉臨床用量應(yīng)盡可能低于氯胺酮低劑量，換算成人的等效劑量為3 mg/kg。

氯胺酮引起腦細(xì)胞凋亡以皮層區(qū)或海馬區(qū)為主，相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道如下:氯胺酮20 mg/kg注射乳鼠后24 h凋亡細(xì)胞及 Caspase－3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多，其中以皮層區(qū)多見(jiàn)［8］;氯胺酮 25 mg/kg 和50 mg/kg注射乳鼠后24 h，SD大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞大量凋亡［3］。本研究發(fā)現(xiàn)，氯胺酮 20 mg/kg和80 mg/kg注射乳鼠后24 h主要引起皮層區(qū)神經(jīng)細(xì)胞凋亡，對(duì)海馬區(qū)神經(jīng)細(xì)胞影響不明顯。本研究提示，氯胺酮一次性麻醉乳鼠引起腦細(xì)胞凋亡的靶器官主要是皮層區(qū)，而成年大鼠多次麻醉時(shí)腦細(xì)胞凋亡的靶器官主要是海馬區(qū)［7，9］，這值得進(jìn)一步深入研究其不同的作用機(jī)制。

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Effect of Ketamine on Triggering Neuronal Apoptosis in the Neonatal Rat Brain

RAO Zi－liang1，NI Jin2，ZHONG Zhi－yong1，SUN Xia1，ZHONG Hai－chao1，WANG Gang1，CHEN Xi－gu1
(1.Guangdong Medical Laboratory Animal Center，F(xiàn)oshan 528248，China;2.Guangzhou Children＇s Hospital，Guangzhou 510120，China)

Objective To investigate the effect of ketamine on neuronal apoptosis in the neonatal rat brain.Methods Fifteen 7－day－old Sprague－Dawley rats were randomly divided into 3 groups(n=5 each)，and

intraperitoneal(i.p)injection with saline(control)，keamine 20 mg/kg and ketamine 80 mg/kg respectively.Apoptotic neurons were observed by the terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick－end labeling(TUNEL)and the Caspase－3 expression was detected by immunohistochemical method.Results Compared with the control group，the TUNEL positive cells were increased but no obvious difference(P ＞0.05)，the Karyopyknosis neuron number and the Caspase－3 positive cells were significantly increased in 20 mg/kg ketamine group(P ＜ 0.05)，the TUNEL positive cells，the Karyopyknosis neuron number and the Caspase－3 positive cells were significantly increased in 80 mg/kg ketamine group(P＜0.05).The apoptotic cells，the Karyopyknosis neuron number and the Caspase positive cells in ketamine group were mostly seen in cortical area.Conclusions 80 mg/kg ketamine can induce neuronal apoptosis in the neonatal rat brain，the cortical area is the main target organ，Caspase－3 activation may be one of the mechanisms.The effect of 20 mg/kg Ketamineon triggering neuronal apoptosis in the neonatal rat brain is minor，the clinical equivalent dose of 20 mg/kg ketamine is 3 mg/kg.The amount of ketamine anesthesia in children should not be too many for avoiding causing brain cells apoptosis.

Ketamine;Neonatal rat;Brain cells apoptosis;Caspase－3;Cortical area

圖1 對(duì)照組神經(jīng)元(HE染色)Fig.1 Control group neuron (HE)

圖2 氯胺酮低劑量組神經(jīng)元(HE染色)Fig.2 Ketamine loW-dose group neuron (HE)

圖3 氯胺酮高劑量組神經(jīng)元(HE染色)Fig.3 Ketamine high-dose group neuron (HE)

圖4 對(duì)照組凋亡細(xì)胞(TUNEL染色)Fig.4 Control group neuron (TUNEL)

圖5 氯胺酮低劑量組凋亡細(xì)胞(TUNEL染色)Fig.5 Ketamine loe-dose group neuron (TUNEL)

圖6 氯胺酮高劑量組凋亡細(xì)胞(TUNEL染色)Fig.6 Ketamine high-dose group neuron (TUNEL)

圖7 對(duì)照組皮層區(qū)(IHC-P)Fig.7 Control group neuron (IHC-P)

圖8 氯胺酮低劑量組皮層區(qū)(IHC-P)Fig.8 Ketamine loW-dose group neuron (IHC-P)

圖9 氯胺酮高劑量組皮層區(qū)(IHC-P)Fig.9 Ketamine high-dose group neuron (IHC-P)

R971.2

A

1671－7856(2010)09－0037－04

2010－03－23

2009年廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(A2009131)。

饒子亮(1983－)，男，實(shí)驗(yàn)師，從事實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腫瘤學(xué)及細(xì)胞學(xué)研究工作。

倪錦，男，副主任醫(yī)師，主要從事麻醉藥物對(duì)幼年動(dòng)物神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育影響的研究。E－mail:drnijin@126.com。