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    Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建及鑒定

    2010-02-16 14:55:24石桂英全雄志陳顯達(dá)陳陟陽(yáng)張連峰鞠振宇
    關(guān)鍵詞:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒

    石桂英,全雄志,陳顯達(dá),陳陟陽(yáng),董 偉,張連峰,鞠振宇

    (中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所,北京 100021)

    Cramp(cathelin-related antimicrobial peptide)基因,位于9號(hào)染色體,其編碼蛋白為cathelin-related antimicrobial peptide,即cathelicidin。該類蛋白是在哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一類結(jié)構(gòu)多變的抗微生物肽,因在表達(dá)的信號(hào)肽與成熟肽之間含有一高度保守的cathelin肽段而自成一家族[1]。Cathelicidin是宿主免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分。目前已知其主要功能是抗菌活性,此外,還具有抑制組織損傷、促進(jìn)創(chuàng)傷修復(fù)、結(jié)合內(nèi)毒素、誘導(dǎo)血管生成等多種生物學(xué)功能。Jiang等[2]研究發(fā)現(xiàn),Cramp在衰老的組織和器官中高表達(dá),并與肝硬化等慢性病相關(guān)。為深入研究Cramp在衰老中的作用及機(jī)制,我們構(gòu)建了Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠。

    1 材料和方法

    1.1 Cramp表達(dá)載體及轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建

    將Cramp cDNA重組到pcDNA3.1+載體中,用Sac I(寶生物工程有限公司)酶切線性化載體,調(diào)整濃度為5ng/μL。用顯微注射法將上述線性化片段注射入BDF1小鼠受精卵內(nèi),用ICR小鼠做假孕受體[小鼠購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所康藍(lán)公司,XCXK(京)2004-001],制備轉(zhuǎn)基因小鼠。實(shí)驗(yàn)中設(shè)計(jì)動(dòng)物的操作程序已經(jīng)得到中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用與管理委員會(huì)的批準(zhǔn),批準(zhǔn)號(hào)為GC05004。

    1.2 PCR方法鑒定Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型

    用2周齡小鼠尾尖堿裂解法提取基因組DNA,PCR鑒定基因型。PCR上游引物為5′GGCTGTGGCGGTCACTATC 3′,下游引物為5′TCACCACCCCCTGTTCCTT 3′,引物由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL(試劑購(gòu)自寶生物工程有限公司)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;94℃變性30s,60℃退火30s,72℃延伸30s,35個(gè)循環(huán);72℃延伸10min。目的片段長(zhǎng)度為276bp。

    1.3 RT-PCR檢測(cè)Cramp基因表達(dá)

    取2~3月齡F1代Cramp轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性及同窩陰性小鼠,Trizol提取小鼠骨髓總RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Ferments)反轉(zhuǎn)錄成cDNA,RT-PCR檢測(cè)Cramp基因表達(dá)水平。引物同1.2,產(chǎn)物長(zhǎng)度276bp。用glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogease(GAPDH)基因做內(nèi)參,用FAM標(biāo)記的Taqman探針監(jiān)測(cè)內(nèi)參,用SYBR GREEN監(jiān)測(cè)目的基因。Taqman探針為ABI公司生產(chǎn)。

    1.4 Western blotting檢測(cè)Cramp蛋白表達(dá)

    取2~3月齡F1代Cramp轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性及同窩陰性小鼠的肝臟,液氮速凍,切割組織5mg,加入蛋白裂解液600μL,超聲破碎組織30s,間隔10s,至組織完全破碎,加入6×蛋白上樣緩沖液,沸水煮10min,分裝后,凍存于-80℃,備用。肝臟總蛋白進(jìn)行SDS-PAGE梯度膠電泳(4%~12%聚丙烯酰胺梯度凝膠購(gòu)自百事創(chuàng)新公司),蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜上(Millipore),用5%BSA封閉。一抗(Santa Cruz公司生產(chǎn))為兔抗鼠Cramp,二抗(購(gòu)自中杉金橋公司)為HRP標(biāo)記羊抗兔。HRP標(biāo)記的鼠抗β-actin(購(gòu)自中杉金橋公司)為內(nèi)參。曝光液為Thermo公司生產(chǎn)。

    2 結(jié)果

    2.1 重組質(zhì)粒Cramp-pcDNA3.1+的鑒定

    圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Electrophoretic identification of recombinant plasmid with restriction enzyme digestion

    將重組質(zhì)粒Cramp-pcDNA3.1+分別用NotⅠ、HindⅢ進(jìn)行酶切電泳后得到544bp的小片段,與預(yù)期大小一致,且連接方向正確,將此重組質(zhì)粒送上海生工生物技術(shù)有限公司進(jìn)行序列分析,確認(rèn)Cramp-pcDNA3.1+序列正確(圖1)。

    2.2 Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠的獲得及F0代轉(zhuǎn)基因小鼠基因型鑒定

    將Cramp-pcDNA3.1+用SacⅠ酶切后回收純化的片段顯微注射到小鼠受精卵的雄原核中。共注射受精卵344枚,成活275枚,將存活的受精卵移植到10只假母,共產(chǎn)子鼠75只,鼠尾DNA鑒定陽(yáng)性14只,即為F0代。部分鑒定結(jié)果見(jiàn)圖2。

    圖2 部分F0代小鼠鑒定結(jié)果Fig.2 PCR analysis of some of F0 generation mice

    2.3 RT-PCR檢測(cè)Cramp基因表達(dá)結(jié)果

    每個(gè)founder取2只PCR鑒定陽(yáng)性小鼠,提RNA后反轉(zhuǎn)錄,經(jīng)實(shí)RT-PCR檢測(cè),有5個(gè)founder為高表達(dá)的,分別為L(zhǎng)-2、4、9、10、13、14。部分結(jié)果見(jiàn)圖3。

    圖3 RT-PCR結(jié)果Fig.3 RT-PCR results

    2.4 Western blotting檢測(cè)Cramp蛋白表達(dá)結(jié)果

    每個(gè)Founder取2只PCR鑒定陽(yáng)性小鼠,取肝臟組織提起蛋白樣品,Western blotting鑒定3個(gè)品系為高表達(dá)品系,L-3、13、14,部分結(jié)果見(jiàn)圖4。

    圖4 Western blotting結(jié)果Fig.4 Identification of Cramp protein by Western blotting

    3 討論

    本研究,成功構(gòu)建了Cramp cDNA載體,用顯微注射法建立了Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠,獲得14只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠,將這些小鼠與C57野生型小鼠交配,產(chǎn)生F1代轉(zhuǎn)基因小鼠。通過(guò)對(duì)F1代小鼠進(jìn)行RTPCR和Western blotting鑒定,篩選出3個(gè)高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠品系。從RT-PCR和Western blotting結(jié)果可以看到,轉(zhuǎn)基因小鼠Cramp的表達(dá)量明顯高于陰性對(duì)照小鼠,我們可以應(yīng)用此轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究Cramp的功能及作用機(jī)制。目前對(duì)Cramp的研究多集中于其抗菌作用[3-5],Jiang等[2]研究發(fā)現(xiàn),Cramp蛋白在衰老的組織和器官中高表達(dá),但其在衰老中的作用及機(jī)制尚需深入研究。我們構(gòu)建的Cramp轉(zhuǎn)基因小鼠為這方面研究提供了動(dòng)物模型。

    [1]Gallo RL,Kim KJ,BernfieldM,etal.Identification of CRAMP,a cathelin-related antimicrobial peptide expressed in the embryonic and adult mouse[J].J Biol Chem,1997,272:13088-13093.

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    [3]Kang SW,Lee DG,Yang ST,et al.CRAMP analog having potent antibiotic activity without hemolytic activity[J].Protein Pept Lett,2002,9:275-282.

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