應(yīng)用細(xì)胞模型研究蜂膠醇提物的抗氧化活性

吳正雙，董 捷，張紅城，趙亮亮，高文宏*

應(yīng)用細(xì)胞模型研究蜂膠醇提物的抗氧化活性

吳正雙1,2，董 捷2，張紅城2，趙亮亮3，高文宏1,*

(1.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；3.哈爾濱商業(yè)大學(xué)食品工程學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150028)

為了研究蜂膠醇提物在細(xì)胞內(nèi)的抗氧化活性(CAA)，本實(shí)驗(yàn)將2′, 7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)熒光探針裝載到人肝癌Hep G2細(xì)胞內(nèi)，然后被進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的2, 2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(ABAP)產(chǎn)生的活性氧氧化成有熒光的二氯熒光(DCF)；以熒光值為指標(biāo)，使用多功能酶標(biāo)儀和熒光倒置顯微鏡分析蜂膠醇提物清除活性氧的能力。結(jié)果表明：蜂膠醇提物具有明顯的抗氧化活性，并呈現(xiàn)良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)CAA值達(dá)到50時(shí)，蜂膠醇提物質(zhì)量濃度僅0.14mg/mL；當(dāng)蜂膠醇提物質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的活性氧顯著減少，有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)幾乎減少一半，清除率接近50%。蜂膠醇提物具有非常好的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力。

人肝癌Hep G2 細(xì)胞；活性氧(ROS)；細(xì)胞內(nèi)抗氧化

活性氧(reactive oxygen species，ROS)是指化學(xué)性質(zhì)活潑的氧代謝產(chǎn)物，包括超氧陰離子自由基、羥自由基、單線(xiàn)態(tài)氧和過(guò)氧化氫?；钚匝踉谌梭w中發(fā)揮著重要作用，但過(guò)量的活性氧會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此清除人體中過(guò)量的活性氧是十分重要的[1-2]。目前抗氧化作用的評(píng)價(jià)方法主要是體外化學(xué)法，包括清除DPPH(二苯代苦味?；杂苫?自由基法、ABTS自由基法、總自由基捕獲抗氧化參數(shù)法(TRAP)、總氧自由基清除能力檢測(cè)法(TOSC)、氧自由基吸收能力(ORAC)法、Fe3+還原(FRAP)法[3-4]。盡管化學(xué)方法因?yàn)楹?jiǎn)單方便，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用，但很多化學(xué)方法不是在生理pH值和溫度條件下進(jìn)行的，也沒(méi)有考慮抗氧化劑在體內(nèi)的吸收、代謝及其生理活性，不能準(zhǔn)確反映抗氧化劑的體內(nèi)抗氧化能力。生物系統(tǒng)比簡(jiǎn)單的化學(xué)物系統(tǒng)復(fù)雜的多，并且抗氧化劑可能通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮效用。因此最好的測(cè)定方法是用動(dòng)物模型和人體試驗(yàn)，但是這些方法成本昂貴且費(fèi)時(shí)，也不適合食品以及膳食組分中原始抗氧化劑的篩選。細(xì)胞培養(yǎng)模型為研究提供了一種經(jīng)濟(jì)的、相對(duì)較快的方法，并且能夠闡明吸收、運(yùn)輸和代謝中的一些機(jī)理問(wèn)題[5]。因此有必要建立一種以細(xì)胞為基礎(chǔ)的測(cè)定抗氧化劑活性的方法，并藉此方法研究食品中或者植物化學(xué)物的一些潛在的具有抗氧化活性的物質(zhì)。

近年來(lái)研究人員從許多天然化學(xué)產(chǎn)物中提取到的抗氧化劑多為多酚和黃酮類(lèi)化合物。蜂膠是蜜蜂從植物芽胞或樹(shù)干采集的樹(shù)膠，混入蜜蜂的上額腺、蜂蠟而形成的芳香性樹(shù)脂狀固體物質(zhì)，主要含黃酮類(lèi)、萜烯類(lèi)、酯類(lèi)、醇類(lèi)、酚類(lèi)、有機(jī)酸、礦物質(zhì)等[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用細(xì)胞模型，在Kelly等[3]的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用細(xì)胞抗氧化(CAA)法，以人肝癌Hep G2細(xì)胞、熒光探針為媒介，以熒光強(qiáng)度為指標(biāo)，使用多功能酶標(biāo)儀和熒光倒置顯微鏡分析蜂膠醇提物的抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蜂膠醇提物 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所；人肝癌Hep G2細(xì)胞株 中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

含青霉素和鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液、PBS Solarbio公司；0.25%胰酶-EDTA消化液、胎牛血清Gibco公司；培養(yǎng)皿、96孔板 Corning公司；細(xì)胞培養(yǎng)級(jí)二甲基亞砜(DMSO)、2′,7′-二氯熒光二乙酸鹽(DCFH-DA)、2,2′-偶氮二異丁基脒二鹽酸鹽(2,2′-azobis (2-amidinopropane) Dihydrochloride，(ABAP) Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AL204型精密天平 上海梅特勒-托利多儀器有限公司；HERA-cell150 CO2培養(yǎng)箱 美國(guó)Thermo公司；5417R型冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf 公司；SynergyTMHT型多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Bio-Tek公司；IX71型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 方法

1.3.1 試劑配制

蜂膠醇提物溶液：稱(chēng)取0.1g蜂膠溶于10mL DMSO中，配成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，4℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

DCFH-DA熒光探針：稱(chēng)取50mg DCFH-DA溶于10mL DMSO中，配成質(zhì)量濃度為5mg/mL的溶液，－20℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

ABAP工作液：稱(chēng)取0.1g ABAP溶于10mL PBS中，配成質(zhì)量濃度為10mg/mL的溶液，－20℃保存?zhèn)溆?，?shí)驗(yàn)前用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)液進(jìn)行稀釋。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將人肝癌Hep G2細(xì)胞用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液在5%CO2、37℃、飽和濕度條件下的CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)[7]。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的測(cè)定[8]

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2細(xì)胞，接種于96孔板培養(yǎng)板(不使用外邊的孔，因?yàn)檫@些孔比內(nèi)部孔變動(dòng)大)，每個(gè)孔約含6 × 104個(gè)細(xì)胞，加入100μL RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)24h后除去培養(yǎng)液，PBS清洗一次。加入新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液、蜂膠醇提物溶液、DCFH-DA熒光探針溶液，使得蜂膠醇提物的終質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔；DCFH-DA終濃度為25μmol/L，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h。100μL PBS清洗細(xì)胞3次，加入ABAP 工作液使ABAP的終濃度為600μmol/L，用多功能酶標(biāo)儀測(cè)其熒光值，測(cè)定條件：激發(fā)波長(zhǎng)為485nm，發(fā)射波長(zhǎng)為580nm，1h內(nèi)每5min測(cè)定一次。對(duì)照組用DCFH-DA和ABAP處理，不加蜂膠醇提物；空白組用DCFH-DA處理，不加入ABAP和蜂膠醇提物。

1.3.4 細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性(CAA)的測(cè)定[3]

用Origin 8.0軟件計(jì)算時(shí)間-熒光強(qiáng)度曲線(xiàn)下的積分面積，并按照以公式(1)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性值(CAA)。

式中：∫SA表示加入不同質(zhì)量濃度蜂膠醇提物后的熒光值-時(shí)間曲線(xiàn)的積分面積；∫CA表示對(duì)照組熒光值-時(shí)間曲線(xiàn)的積分面積。

1.3.5 熒光倒置顯微鏡觀(guān)察測(cè)定蜂膠醇提物的細(xì)胞內(nèi)活性氧清除率

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hep G2細(xì)胞，配制成2×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100μL，CO2培養(yǎng)箱孵育24h后棄去培養(yǎng)基，PBS洗一次。加入新鮮RPMI-1640培養(yǎng)液、蜂膠醇提物溶液、DCFH-DA熒光探針溶液，使得蜂膠醇提物的終質(zhì)量濃度分別為0.025、0.05、0.1、0.25、0.5mg/mL，DCFH-DA終濃度為25μmol/L，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1h。PBS清洗細(xì)胞 3次，加入800μmol/L ABAP，37℃避光反應(yīng)30min，因?yàn)镈CF熒光信號(hào)為綠色，故在藍(lán)色光激發(fā)下用熒光倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞并計(jì)數(shù)，每種質(zhì)量濃度的蜂膠醇提物處理的細(xì)胞在明場(chǎng)和熒光模式下均選取3個(gè)視野計(jì)數(shù)，數(shù)據(jù)以x±s表示。按照公式(2)計(jì)算細(xì)胞內(nèi)活性氧清除率(IC)。

式中：A為熒光模式下3個(gè)視野中陽(yáng)性Hep G2細(xì)胞的平均數(shù)；B為明場(chǎng)下3個(gè)視野中Hep G2細(xì)胞的平均數(shù)。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以x±s表示，用Origin 8.0軟件計(jì)算曲線(xiàn)積分面積，應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行方差分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜂膠醇提物對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響

圖1 不同質(zhì)量濃度蜂膠醇提物對(duì)細(xì)胞熒光強(qiáng)度的影響Fig.1 Effect of adding different amounts of EEP on cellular fluorescence intensity

由圖1看出，細(xì)胞熒光強(qiáng)度隨蜂膠醇提物質(zhì)量濃度的增加而下降，且加入蜂膠醇提物的細(xì)胞熒光強(qiáng)度與空白組相比均有顯著性差異(P＜0.05)。實(shí)驗(yàn)中的DCFH-DA本身沒(méi)有熒光，它可以自由穿過(guò)細(xì)胞膜，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)后，可以被細(xì)胞內(nèi)的酯酶水解生成無(wú)熒光的DCFH。而DCFH不能通透細(xì)胞膜，從而使DCFH-DA熒光探針很容易地被裝載到細(xì)胞內(nèi)。同時(shí)，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的ABAP裂解成活性氧(ROS)，可以氧化DCFH生成有熒光的DCF，檢測(cè)DCF的熒光強(qiáng)度就可以反應(yīng)細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平。熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)活性氧水平呈正比，熒光強(qiáng)度越高，活性氧含量越高。蜂膠醇提物能顯著降低細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，這說(shuō)明蜂膠醇提物能夠降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，具有明顯的抗氧化作用，抗氧化作用隨著蜂膠醇提物質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，并呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。本實(shí)驗(yàn)中蜂膠醇提物質(zhì)量濃度為0.5mg/mL時(shí)，抗氧化效果達(dá)到最高。

2.2 細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性(CAA)測(cè)定

圖2 蜂膠醇提物抑制ROS氧化DCFH的劑量-效應(yīng)曲線(xiàn)Fig.2 Dose-response curve of inhibitory effect of EEP on ROS-induced DCFH oxidation

由圖2可知，蜂膠醇提物具有明顯的抗氧化活性，并且存在一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系，即抗氧化作用隨蜂膠醇提物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)。CAA 值達(dá)到50(即CAA50)時(shí)，蜂膠醇提物的質(zhì)量濃度為0.14mg/mL。Kelly等[3]曾做過(guò)藍(lán)莓的細(xì)胞抗氧化實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)藍(lán)莓的CAA50對(duì)應(yīng)的藍(lán)莓質(zhì)量濃度為2～3mg/mL。由此表明，與藍(lán)莓相比，蜂膠的抗氧化能力更強(qiáng)。

2.3 熒光倒置顯微鏡觀(guān)察計(jì)數(shù)測(cè)定蜂膠醇提物的細(xì)胞內(nèi)活性氧清除率

Liu等[5]采用的細(xì)胞模型主要是測(cè)定抗氧化劑的CAA值，由于細(xì)胞接種96孔板后，需要培養(yǎng)24h，每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)會(huì)有所差異，熒光強(qiáng)度不穩(wěn)定性，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)有一定影響。因此在其基礎(chǔ)上用熒光倒置顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化，將有熒光和無(wú)熒光的細(xì)胞分別計(jì)數(shù)，可以更加直觀(guān)地、準(zhǔn)確地看出蜂膠醇提物的抗氧化能力。

細(xì)胞內(nèi)的活性氧可以氧化無(wú)熒光的DCFH生成有綠色熒光的DCF。加入抗氧化劑，可以清除細(xì)胞內(nèi)活性氧，使生成的DCF減少，即有綠色熒光的細(xì)胞數(shù)也減少。在熒光倒置顯微鏡的明場(chǎng)條件下測(cè)定細(xì)胞總數(shù)，在熒光觀(guān)察條件下測(cè)定被活性氧氧化而發(fā)出綠色熒光的細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算二者的比值來(lái)判斷蜂膠醇提物的抗氧化活性。

圖3 熒光倒置顯微鏡下觀(guān)察蜂膠醇提物的抗氧化效果Fig.3 Antioxidant effect of EEP observed under converted fluorescence microscope

表1 蜂膠醇提物細(xì)胞內(nèi)活性氧清除率Table 1 Cellular ROS clearance rates of EEP at different concentrations

圖3是各實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞在明場(chǎng)和熒光模式下觀(guān)察到的有代表性的照片?？瞻讟悠凡唤?jīng)蜂膠處理，細(xì)胞幾乎都被染色。經(jīng)不同質(zhì)量濃度的蜂膠醇提物處理后，被染色的細(xì)胞有所減少，并且隨質(zhì)量濃度的增加而減少(P＜0.05)。從表1可知，蜂膠醇提物有很強(qiáng)的清除細(xì)胞內(nèi)活性氧的能力，隨著蜂膠醇提物質(zhì)量濃度的增加，清除率從15.38%提高到47.05%。也就是說(shuō)，當(dāng)質(zhì)量濃度達(dá)到0.5mg/mL時(shí)，生成的DCF減少，有熒光的細(xì)胞數(shù)減少，幾乎有一半的細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有熒光，細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除率接近50%。

本實(shí)驗(yàn)室曾做過(guò)蜂膠醇提物的化學(xué)抗氧化實(shí)驗(yàn)，已經(jīng)證實(shí)了蜂膠醇提物具有明顯的抗氧化作用[9]。本次實(shí)驗(yàn)是以活細(xì)胞為模型研究蜂膠醇提物的抗氧化作用，發(fā)現(xiàn)蜂膠具有明顯的抗氧化活性，這與以前的化學(xué)法抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。CAA法與化學(xué)法相比，能更有力的證明蜂膠的體內(nèi)抗氧化作用。

蜂膠中起抗氧化作用的主要成分之一是黃酮類(lèi)化合物，但并不是所有的黃酮化合物都有抗氧化活性，只有分子結(jié)構(gòu)滿(mǎn)足一定條件時(shí)才能表現(xiàn)出較強(qiáng)的作用，其中最主要的是羥基化程度和羥基的位置，且一般認(rèn)為B環(huán)中的鄰-二羥基起著主要作用[10]。為了進(jìn)一步研究蜂膠的抗氧化活性，可以用蜂膠的水提物、乙醚提取物、超臨界提取物等繼續(xù)做細(xì)胞內(nèi)抗氧化實(shí)驗(yàn)；特別是色譜分離技術(shù)的發(fā)展，為分離分析蜂膠中單一的功能性化合物及進(jìn)一步研究評(píng)價(jià)其生理活性功效帶來(lái)了新的技術(shù)支持；同時(shí)也可以嘗試其他能夠模擬生物體評(píng)估抗氧化能力的生物學(xué)方法。

目前公認(rèn)的可以模擬生物體評(píng)估抗氧化能力的3種方法：ORAC法、CAP-e方法[11]、CAA法都使用了熒光探針。借助探針，研究人員能夠在很短時(shí)間內(nèi)獲得所需活性氧的相關(guān)信息，其理論依據(jù)是借助活性氧的某些特性，使得原來(lái)不產(chǎn)生熒光的探針轉(zhuǎn)變成具有熒光特性的化合物，或使檢測(cè)探針原本具有熒光變?nèi)跎踔潦氢纾ㄟ^(guò)對(duì)熒光強(qiáng)度改變的測(cè)定間接實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)活性氧的量化分析。熒光探針是一個(gè)非常有發(fā)展前景的揭示分子生物功能的工具，它能夠提供有機(jī)細(xì)胞系統(tǒng)內(nèi)目標(biāo)分子短暫的空間信息，這為深入了解活性氧的特性提供了一條新的途徑。

本實(shí)驗(yàn)雖然可以證明蜂膠具有抗氧化活性，但存在不足之處：一是蜂膠醇提物具有誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡的作用，本實(shí)驗(yàn)室也做了蜂膠醇提物誘導(dǎo)人肝癌Hep G2細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)，用蜂膠處理Hep G2細(xì)胞，會(huì)殺死細(xì)胞，可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；二是細(xì)胞接種于96孔板后，需要培養(yǎng)24h，每個(gè)孔中的細(xì)胞數(shù)會(huì)有所差異，對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果也會(huì)有一定影響；三是用熒光倒置顯微鏡觀(guān)察，不同視野細(xì)胞數(shù)會(huì)有所不同，被染色的細(xì)胞數(shù)也會(huì)不同，不能十分準(zhǔn)確的計(jì)算實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 結(jié) 論

采用細(xì)胞模型研究不同質(zhì)量濃度的蜂膠醇提物處理Hep G2細(xì)胞前后熒光強(qiáng)度以及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目的變化，結(jié)果表明蜂膠醇提物具有很好的抗氧化作用，隨著蜂膠醇提物質(zhì)量濃度的增大而增強(qiáng)，并呈良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。CAA值達(dá)到50時(shí)，蜂膠醇提物質(zhì)量濃度僅0.14mg/mL，是藍(lán)莓CAA50的十分之一。當(dāng)蜂膠醇提物質(zhì)量濃度達(dá)到0.5mg/mL，細(xì)胞內(nèi)活性氧的清除率高達(dá)47.05%。因此可以認(rèn)為，蜂膠醇提物具有非常好的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力，可以作為天然的抗氧化劑開(kāi)發(fā)出保健食品。

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Application of Cell Culture Model to Antioxidant Activity Analysis of an Ethanol Extract from Propolis

WU Zheng-shuang1,2，DONG Jie2，ZHANG Hong-cheng2，ZHAO Liang-liang3，GAO Wen-hong1,*
(1. College of Light Industry and Food, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China；2. Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China；3. College of Food Engineering, Harbin University of Commerce, Harbin 150028, China)

A cellular antioxidant activity (CAA) assay for quantifying the antioxidant activity of an ethanol extract from propolis (EEP) provided by Bee Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences has been developed. Dichlorofluoresceindiacetate (DCFH-DA) as a probe, which is easily oxidized into fluorescent dichlorofluorescein (DCF) by reactive oxygen species (ROS), was trapped within cells and the method was used to measure the ability of EEP to prevent the formation of DCF by 2,2′-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride (ABAP)-generated peroxyl radicals in human liver carcinoma HepG2 cells with multi-functional microplate reader and inverted fluorescence microscope. The decrease in cellular fluorescence intensity compared to the control cells indicates the antioxidant capacity of EEP. In addition, this bioactivity depended on dose. The concentration of EEP corresponding to CAA unit50 was only 0.14 mg/mL. A ROS clearance rate of 47.05% was obtained at an EEP concentration of 0.5 mg/mL.

human liver carcinoma HepG2 cells；reactive oxygen species；cellular antioxidant activity

S896

A

1002-6630(2010)19-0190-04

2010-05-31

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)(蜂)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專(zhuān)項(xiàng)(NYCYTX-43)；農(nóng)業(yè)部公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(nyhyzx07-041)

吳正雙(1985—)，男，碩士研究生，主要從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail：zhshwu1208@163.com

*通信作者：高文宏(1970—)，女，副教授，博士，主要從事食品質(zhì)量與安全研究。E-mail：zzhc@sohu.com