南山楂葉黃酮抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基的作用

董華強(qiáng)，甄暢迪，張 毅，李 梅，劉富來，黃劍波

南山楂葉黃酮抑制α-葡萄糖苷酶和清除DPPH自由基的作用

董華強(qiáng)1，甄暢迪1，張 毅2，李 梅1，劉富來1，黃劍波1

(1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)系，廣東 佛山 528231；2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東 廣州 510641)

目的：研究南山楂葉黃酮提取物(SZ)對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用和抗氧化活性。方法：檢測(cè)SZ對(duì)來源于酵母菌的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用，并采用Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線研究其抑制機(jī)理；測(cè)定SZ對(duì)DPPH自由基的清除率，考察其抗氧化活性。結(jié)果：SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率可達(dá)到64.3%，屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制；對(duì)DPPH自由基的清除率可達(dá)52.8%，IC50值為0.57mg/mL。結(jié)論：SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制作用和具有一定的抗氧化活性。

南山楂葉；黃酮；α-葡萄糖苷酶；抑制作用；抗氧化

山楂為薔薇科植物山里紅(C. pinnatifida Bunge var. major N. E. Br.)、山楂(C. pinnatifida Bge)或野山楂(C. cuneata Sieb. et Zucc.)的干燥成熟果實(shí)。前兩種習(xí)稱北山楂，后一種習(xí)稱南山楂。除了果實(shí)，山楂葉也可入藥，用于活血化淤，理氣通脈[1]。2005年版《中國(guó)藥典》也正式收載山楂葉。近年來，用山楂治療心血管方面疾病的研究較多。葉希韻等[2-4]研究表明，山楂葉黃酮對(duì)防治糖尿病及其并發(fā)癥有積極的作用。1990年版中國(guó)藥典一部未將南山楂收入[5]，對(duì)南山楂的研究報(bào)道也很少。一些學(xué)者對(duì)此有不同看法，虞人榮[6]甚至認(rèn)為南山楂的治療作用優(yōu)于正品山楂。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.20)是位于小腸黏膜上的寡糖水解酶，與餐后血糖水平升高密切相關(guān)[7]。阿卡波糖(acarbose)是臨床上廣泛應(yīng)用的控制餐后血糖的有效藥物，其藥效機(jī)理就是抑制小腸黏膜的α-葡萄糖苷酶活性[8]。由于阿卡波糖存在明顯的副作用[9-12]，人們一直在尋找天然無副作用的α-葡萄糖苷酶抑制劑[13-15]。有報(bào)道從植物中提取分離得到一些天然α-葡萄糖苷酶抑制劑，沒有阿卡波糖等藥物的副作用[16]。本實(shí)驗(yàn)對(duì)南山楂葉黃酮提取物的α-葡萄糖苷酶抑制活性和抗氧化活性進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南山楂(C. cuneata Sieb. Et Zucc.)干葉購于廣東陽山縣城。

α-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.20)、DPPH、對(duì)硝基苯-β-D-半乳糖吡喃糖苷 美國(guó)Sigma公司；阿卡波糖(acarbose) 德國(guó)拜耳公司；95%乙醇、甲醇、乙酸乙酯均為分析純 上?；瘜W(xué)試劑廠；茶多酚(TP，含量70%)、蘆丁(含量95%) 上海同田生物技術(shù)有限公司。1.2儀器與設(shè)備

UV-260紫外-可見分光光度儀 日本島津公司；M2e 酶標(biāo)儀(micro-plate reader) 美國(guó)Molecular device公司；HH數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠；TGL-16臺(tái)式離心機(jī) 長(zhǎng)沙市平凡儀器儀表有限公司；旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 南山楂葉黃酮提取

稱取南山楂葉40g，粉碎后移入圓底燒瓶，加入500mL 80%乙醇溶液，置于75℃水浴鍋中回流2h，過濾并收集濾液。重復(fù)3次，合并濾液，揮干，得到粗提物。稱取粗提物約5g，用50mL的20%乙醇溶液溶解后，加入等體積的乙酸乙酯萃取兩次，合并兩次乙酸乙酯層萃取液，揮干，得到南山楂葉黃酮提取物(SZ)。黃酮提取率和提取物的黃酮純度分別按式(1)、(2)計(jì)算：

式中：m1為南山楂葉黃酮提取物中黃酮質(zhì)量/g；m0為南山楂葉中黃酮質(zhì)量/g；mz為南山楂葉黃酮提取物質(zhì)量/g。

1.3.2 黃酮含量測(cè)定

1.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取0.05g蘆丁，充分溶解于50mL無水乙醇，分別取溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，加蒸餾水定溶至5mL制成梯度濃度。在波長(zhǎng)260nm處測(cè)定吸光度(A260nm)；以蘆丁質(zhì)量濃度(ρ)為橫坐標(biāo)、A260nm為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：A260nm=5.623ρ＋0.2203，r＝0.9897。

1.3.2.2 樣品黃酮含量測(cè)定

測(cè)定樣品液的A260nm值，根據(jù)公式A260nm=5.623ρ+ 0.2203，計(jì)算出樣品黃酮含量。

1.3.3 α-葡萄糖苷酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]的方法，略作修改。取60μL待測(cè)液于96孔酶標(biāo)板中，加入50μL α-葡萄糖苷酶溶液，搖勻后于37℃水浴保溫10min，50μL PNPG溶液搖勻，在37℃水浴中反應(yīng)20min，加入160μL Na2CO3溶液中止酶促反應(yīng)，置于405nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。由于SZ本身有顏色，因此每個(gè)樣品需要測(cè)定背景吸收，并對(duì)最終測(cè)定結(jié)果進(jìn)行校正。每個(gè)樣品重復(fù)3次取平均值。抑制率按式(3)計(jì)算。

式中：Aj為樣品組吸光度；A0為空白對(duì)照組吸光度。

采用Lineweaver-Burk作圖法，對(duì)SZ抑制α-葡萄糖苷酶活性的機(jī)理進(jìn)行分析。

1.3.4 清除DPPH自由基能力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[17]方法，略作修改。以甲醇為溶劑，配制不同質(zhì)量濃度的樣品溶液，吸取50μL待測(cè)液于96孔酶標(biāo)板中，加入150μL DPPH溶液，搖勻，25℃條件下避光靜置30min，于波長(zhǎng)517nm處測(cè)定吸光度。按式(4)計(jì)算DPPH自由基清除率。

式中：Q為DPPH自由基清除率；A0為不加試樣DPPH溶液的吸光度；At為加試樣反應(yīng)后 DPPH 溶液吸光度。

以清除DPPH自由基達(dá)到穩(wěn)定態(tài)50%清除率所需加入樣品的質(zhì)量濃度為IC50，用以表示其抗氧化能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 南山楂葉提取物的黃酮含量

按照前述黃酮提取分離和測(cè)定方法，得到SZ的黃酮含量為3.35%，純度為58.2%，提取率為86.9%。

2.2 SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制

圖1 SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Fig.1 α-glucosidase inhibiting effect of the flavonoid-rich extract studied using acarbose and tea polysaccharide as the controls

由圖1可知，陽性對(duì)照阿卡波糖對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用很強(qiáng)，而SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶的活性抑制作用也很明顯，茶多酚對(duì)α-葡萄糖苷酶活性也有一定抑制作用，但抑制率很低。在0.01～0.3mg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈一定量效關(guān)系，抑制效果隨SZ質(zhì)量濃度的增加相應(yīng)增強(qiáng)，在0.3mg/mL時(shí)抑制率達(dá)到64.3%。

2.3 南山楂葉黃酮對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制機(jī)理

以不同質(zhì)量濃度(0.2mg/mL和0.5mg/mL)SZ作為抑制劑，測(cè)定不同底物質(zhì)量濃度α-葡萄糖苷酶酶促反應(yīng)速率(V)，以1/[S]為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線，結(jié)果如圖2所示。

圖2 南山楂黃酮提取物抑制α-葡萄糖苷酶的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線Fig.2 Lineweaver-Burk plot of inhibitory effect of the flavonoid-rich extract onα-glucosidase

由圖2可見，兩條不同質(zhì)量濃度的SZ的Lineweave-Burk雙倒數(shù)曲線相交于X軸的負(fù)值區(qū)，呈現(xiàn)出較典型的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑特征，反應(yīng)速率隨抑制劑質(zhì)量濃度增大而變小，米氏常數(shù)保持不變，說明SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

2.4 南山楂葉黃酮提取物對(duì)DPPH自由基的清除效果

2.4.1 SZ清除率隨時(shí)間的變化

圖3 SZ對(duì)DPPH自由基的清除率隨時(shí)間的變化曲線Fig.3 Time courses of DPPH free radical scavenging effect of the flavonoid-rich extract and vitamin C

由圖3可見，SZ對(duì)DPPH自由基的清除率隨時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增大，在開始反應(yīng)30min后，對(duì)DPPH自由基的清除率達(dá)到最大值51.5%。而VC對(duì)DPPH自由基的清除率在反應(yīng)后20min已接近最大值，達(dá)到78.3%。說明在本實(shí)驗(yàn)體系中，SZ具有一定的抗氧化能力，但清除DPPH自由基的速率比VC慢。

2.4.2 不同質(zhì)量濃度SZ對(duì)DPPH的清除率和IC50值

由圖4可知，在0.1～1.2mg/mL范圍內(nèi)，SZ對(duì)DPPH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系，在1.2mg/mL時(shí)達(dá)到最大值52.8%，IC50值為0.57mg/mL。而VC在0.6mg/mL時(shí)清除率達(dá)到84.5%， IC50值為0.28mg/mL?？梢?，SZ具有一定的抗氧化活性。但無論最大抗氧化能力和達(dá)到一半最大抗氧化能力所需的質(zhì)量濃度(IC50值)，都不如VC。

圖4 不同質(zhì)量濃度SZ、VC對(duì)DPPH自由基的清除率Fig.4 Concentration dependence of DPPH free radical scavenging effect of the flavonoid-rich extract and vitamin C

3 結(jié) 論

3.1 SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制活性，抑制率可達(dá)到64.3%，抑制機(jī)理屬于非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

3.2 SZ具有明顯的清除DPPH自由基能力，清除率可達(dá)52.8 %，IC50值為0.57mg/mL。

綜上所述，SZ對(duì)α-葡萄糖苷酶有較強(qiáng)的抑制活性，并具有一定的抗氧化能力，具有很好的抗糖尿病活性開發(fā)潛力，值得進(jìn)一步深入研究。

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Alpha-glucosidase Inhibiting Effect of DPPH free Radical Scavenging Activity of Flavonoid-rich Extract from Leaves of Crataegus cuneata Sieb. et Zucc

DONG Hua-qiang1，ZHEN Chang-di1，ZHANG Yi2，LI Mei1，LIU Fu-lai1，HUANG Jian-bo1
(1. Department of Food Science, Foshan University, Foshan 528231, China；2. College of Light Industry and Food Sciences, South China University of Technology, Guangzhou 510641, China)

A flavonoid-rich extract obtained by ethyl acetate extraction from the 80% ethanol extract from the leaves of Crataegus cuneata Sieb. et Zucc was evaluated for its alpha-glucosidase inhibiting effect and DPPH free radical scavenging activity. The extract had an inhibitory effect on alpha-glucosidase derived from yeast, and the maximum inhibitory rate was up to 64.3%, and the inhibition was uncompetitive according to the Lineweaver-Burk plot. The maximum DPPH free radical scavenging rate of the extract was up to 52.8%, and the IC50 was 0.57 mg/mL. In conclusion, the extract had strong ability to inhibit yeast-derived alphaglucosidase and certain antioxidant activity.

leaves Crataegus cuneata Sieb. et Zucc；flavonoids；alpha-glucosidase；inhibiting effect；antioxidation

TS201.2

A

1002-6630(2010)19-0179-03

2010-07-05

廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(8152800001000023)

董華強(qiáng)(1958—)，男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工、食品功能性成分化學(xué)與活性評(píng)價(jià)。E-mail：huaqiangdong@163.com