靈芝三萜皂苷(GCTL1)的體外抗氧化作用

崔月花，章克昌

靈芝三萜皂苷(GCTL1)的體外抗氧化作用

崔月花1，章克昌2

(1.揚州大學生物科學與技術學院，江蘇 揚州 225009；2.江南大學 教育部工業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

采用化學模擬體系研究靈芝三萜皂苷(GCTL1)對超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基及過氧化氫自由基的清除能力，測定其還原力和鐵螯合力，并與合成的抗氧化劑進行比較。結果表明，GCTL1具有較好的抗氧化作用。GCTL1清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、過氧化氫自由基的IC50分別為：(0.247± 0.05)、(0.197±0.002)、(0.09±0.02)、(0.279±0.04)mg/mL；還原力為0.5、鐵螯合力為50%時GCTL1質量濃度分別為(0.425±0.01)、(0.180±0.04)mg/mL，并且在一定質量濃度范圍內具有劑量依賴效應；GCTL1的總體抗氧化能力高于VC和2,6二叔丁基對甲酚(BHT)。

靈芝；三萜皂苷；抗氧化活性；清除率

靈芝(Ganoderma. lucidum)是擔子菌綱，多孔菌科，靈芝屬真菌，由于其特殊的藥用價值，靈芝有效成分的分析和藥理作用的研究受到了廣泛的專注[1-5]，尤其在日本、中國、韓國等國家。迄今為止，已從靈芝的子實體、菌絲體及孢子中分離到了150多種化合物，包括糖類、核苷類、呋喃類、生物堿類、氨基酸蛋白質類、三萜類、油脂類、有機鍺化合物類[6-7]等。江南大學生物資源室從靈芝發(fā)酵液中分離到一個新的化合物——靈芝三萜皂甙(GCTL1)[8]。本實驗則進一步綜合評價其抗氧化活性，以期為其今后在臨床上的應用提供前期實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

GLCT1純品由江南大學生物資源室分離純化。分離純化方法見文獻[8]。將靈芝三萜皂苷、對照樣品BHT、VC分別溶于甲醇、去離子水中，配制成0.1、0.2、0.5、1mg/mL的溶液，測定其抗氧化性。

鐵氰化鉀(K3Fe(CN)6)、2,2＇-聯(lián)吡啶(2,2-bipyridyl)、氯化鐵(FeCl3)、三氯乙酸(TCA)、十二烷基磺酸鈉(SDS)、鹽酸羥胺(HAHC)、2,6二叔丁基對甲酚(BHT)、抗壞血酸(VC)等均為分析純 中國醫(yī)藥集團上?；瘜W試劑公司；DPPH Sigma公司。

Multiskanmk3酶標儀 美國Thermo公司。

1.2 方法

1.2.1 GLCT1清除超氧陰離子自由基能力的測定

利用鄰苯三酚自氧化法測定GLCT1對超氧陰離子自由基的清除率。方法參照文獻[9]，略有修改。在比色管中加入Tris-HCl (pH8.2) 4.5mL、待測樣品溶液 1mL、去離子水3.3mL，快速加入10mmol/L鄰苯三酚溶液0.2mL，每隔30s在320nm波長處測定吸光度(A320nm)，并計算鄰苯三酚自氧化速率(s=)?？瞻坠芤愿髯缘娜軇┐鏄悠罚訴C、BHT作陽性對照。

1.2.2 GLCT1清除羥自由基能力測定

羥自由基的測定參考文獻[10]。在10mL的比色管中加入0.75mmol/L的pH值為7.4的磷酸緩沖液1.0mL、番紅(260μg/mL) 0.2mL、EDTA(2mmol/L) 0.375mL、FeSO4(2mmol/L) 2mL，再加入待測樣品溶液0.2mL，最后加入體積分數(shù)3%的H2O2溶液 420mL，混勻后于40℃水浴保溫30min，加入0.5mL 0.15mol/L EDTANa2溶液終止反應，然后在波長520nm處測吸光度(A520nm)。每個樣品濃度作3個平行樣，取其平均值?？瞻捉M以等體積的各自溶劑代替樣品溶液，對照組以等體積的各自溶劑代替樣品溶液和FeSO4溶液。以VC、BHT作陽性對照。

1.2.3 GLCT1清除DPPH自由基能力的測定

參照文獻[11]的方法，略有修改，試管中加入0.5mL待測樣品溶液，2.5mL的6.25×10-5mol/L DPPH甲醇溶液，在30℃條件下孵育30min，在517nm波長處測定吸光度記為A樣品。甲醇調零，DPPH新鮮配制，每次用前放在4℃條件下暗中保存。VC、BHT作陽性對照，空白組以各自的溶劑代替樣品。

1.2.4 GLCT1清除過氧化氫自由基能力的測定

清除過氧化氫的活性測定參照文獻[12]進行，略有修改。取待樣品溶液0.4mL加入3mL的磷酸緩沖液(pH7.4)中，加入600μL 43mmol/L的H2O2溶液，在230nm波長處測定反應液的吸光度，每10min記錄一次，記錄40min，測定反應速率(s=)?？瞻坠芤匀軇┐鏄悠啡芤海琕C、BHT作陽性對照。

1.2.5 GLCT1還原力的測定

還原力的測定按文獻[13]進行，在試管中加入0.5mL待測樣品溶液，2.5mL磷酸緩沖液(200mmol/L，pH 6.6)，2.5mL的質量分數(shù)1%的鐵氰化鉀溶液，在50℃下孵育20min，冷卻后加入2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，并在3000r/min條件下離心，取上清液2.5mL，加入2.5mL蒸餾水，0.5mL 0.5% FeCl3溶液，在700nm波長處測定吸光度，以吸光度代表還原力。VC、BHT作陽性對照，空白組以各自的溶劑代替樣品溶液。

還原力=A樣品－A空白

1.2.6 GLCT1鐵螯合力的測定

鐵螯合力采用2,2＇-聯(lián)吡啶法[14]，反應包括200μL待測樣品溶液，100μL 2% SDS、100μL 1.8mmol/L FeSO4溶液、800μL 0.1% 2,2＇-聯(lián)吡啶溶液(0.2mol/L HCl溶解)、320μL 10%鹽酸羥胺溶液、以及800μL Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，在522nm波長處測定吸光度A樣品，用已知濃度的EDTA溶液，VC溶液作陽性對照，空白組以各自的溶劑代替樣品溶液測定吸光度A空白。

1.2.7 統(tǒng)計分析

所有實驗設3次重復，結果以平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 GCTL1清除超氧陰離子自由基的能力

圖1 不同質量濃度的樣品對清除超氧陰離子自由基的影響Fig.1 Concentration-dependent superoxide anion free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

超氧陰離子自由基可發(fā)生在各種細胞中，可以引起其他的鏈式反應，產生新的自由基和氧化劑，對細胞產生毒害[15]。由圖1可知，在0～0.5mg/mL范圍內GCTL1清除超氧陰離子自由基具有劑量依賴效應，相關性系數(shù)為0.97。GCTL1、VC、BHT的清除率在50%時3種物質的質量濃度分別是(0.247±0.05)、(0.567±0.04)、(10.1± 0.02)mg/mL，說明GCTL1具有很強的清除超氧陰離子自由基的活性，分別是VC、BHT的2.29、40.89倍。

2.2 GCTL1清除羥自由基的能力

圖2 不同質量濃度的樣品對清除羥自由基的影響Fig.2 Concentration-dependent hydroxyl free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

羥自由基是活性最強自由基，也是毒性最大的自由基，可與活細胞中某些生物大分子發(fā)生反應，導致遺傳突變、膜損傷、酶失活、線粒體氧化、磷酸化作用等一系列變化[16]。圖2表明GCTL1具有清除羥自由基的能力，在質量濃度為0～0.5mg/mL范圍內，具有劑量依賴效應，相關性系數(shù)為0.98。GCTL1、VC、BHT清除率在50%時3種物質的質量濃度分別是(0.197±0.002)、(0.226±0.003)、(6.96±0.5)mg/mL，說明GCTL1清除羥自由基的能力高于VC和合成的抗氧化劑BHT，分別是VC和BHT的1.14、35.1倍，是一種極強的羥自由基清除劑。已有報道藥用真菌如Coriolus versicolor、G. lucidum、G. tsugae的甲醇萃取物在16mg/mL清除羥自由基的能力 38.0%～52.6%[17]，說明純品GCTL1也可能是抗氧化的重要化合物。

2.3 GCTL1清除DPPH自由基的能力

DPPH自由基是脂溶性自由基的模型?？寡趸瘎┖虳PPH反應，減少的DPPH分子等于抗氧化劑提供的羥基數(shù)量，因此，在517nm波長處的吸收接近于剩余DPPH分子的數(shù)量，按照動力學分級，依照對時間的特性，已有報道如下：5min前迅速反應，5～30min，反應中速，30 min后，反應變慢[18]。圖3說明了GCTL1、VC、BHT對DPPH自由基的清除情況及不同的動力學，在本研究中，GCTL1具有很好的清除DPPH自由基的能力，在5min內就到了穩(wěn)定的狀態(tài)，VC在5min內達到穩(wěn)態(tài)，BHT的吸收在35min的時候達到穩(wěn)定的狀態(tài)。這和Sanchez-Moreno[19]報道的一致，圖4是不同質量濃度的GCTL1、VC、BHT清除DPPH自由基的效應，GCTL1清除DPPH自由基的能力隨質量濃度的增加而增加，并在0～0.1mg/mL范圍內具有劑量依賴效應。清除率在50%時GCTL1、VC、BHT的質量濃度分別是(0.09± 0.02)、(0.146±0.05)、(3.36±0.3) mg/mL，GCTL1清除DPPH自由基的能力分別是VC、BHT的1.62、37.33倍，可見GCTL1是一種很好的DPPH自由基清除劑。Mau等[20]報道靈芝發(fā)酵液甲醇萃取物10mg/mL時對DPPH自由基的清除率為79.3%，可見GCTL1清除DPPH自由基的效果比靈芝發(fā)酵液甲醇萃取物好，GCTL1很可能是靈芝發(fā)酵液甲醇萃取物中的重要活性物質。

圖3 DPPH自由基在3種樣品中隨時間的變化Fig.3 Kinetic curves of DPPH free radical scavenging by GCTL1, BHT and vitamin C

圖4 不同質量濃度的樣品對清除DPPH自由基的影響Fig.4 Concentration-dependent DPPH free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

2.4 GCTL1清除過氧化氫自由基的能力

圖5 不同質量濃度的樣品對清除過氧化氫自由基的影響Fig.5 Concentration-dependent hydroxyl peroxide free radical scavenging curves of GCTL1, BHT and vitamin C

過氧化氫自由基也是活性氧，是一種不穩(wěn)定的自由基，其代謝產生羥自由基和單線態(tài)氧，進而和細胞內大分子發(fā)生反應，造成細胞損傷[21]。圖5表明了GCTL1、VC、BHT清除過氧化氫自由基的能力，在0～0.5mg/mL范圍內，3種物質在清除過氧化氫自由基方面都有劑量依賴性，相關性系數(shù)為0.95。GCTL1、VC、BHT清除過氧化氫自由基50%的質量濃度分別為(0.279±0.04)、(0.973±0.06)、(10.56±0.06)mg/mL，GCTL1清除過氧化氫自由基的能力分別是VC、BHT的3.48、37.8倍。

2.5 GCTL1的還原力

圖6 不同質量濃度樣品的還原力Fig.6 Concentration-dependent reducing power curves of GCTL1, BHT and vitamin C

還原力可以作為抗氧化評價的一個重要的指標。從圖6可知，GCTL1的還原力隨質量濃度增加而增加，還原力在0.5時GCTL1的質量濃度為(0.425±0.01)mg/mL，而VC、BHT的質量濃度為(0.218±0.005)、(13.63±0.6) mg/mL，GCTL1的還原力較VC低，但是合成抗氧化劑BHT的32.07倍，GCTL1可以作為一種較好的還原劑。在相同體系下測定還原力時，靈芝甲醇萃取物質量濃度為1.5mg/mL時的還原力是0.81[17]，說明GCTL1的還原力要好于靈芝甲醇萃取物。

2.6 GCTL1對鐵離子的螯合能力

圖7 不同質量濃度樣品的鐵螯合能力Fig.7 Concentration-dependent ferric-chelating capacity curves of GCTL1, BHT and vitamin C

鐵離子在食物系統(tǒng)中是最有效的前氧化劑[19]。消除過量的鐵離子也能阻斷機體產生過量的自由基。因此對金屬離子螯合率的測定也是評價抗氧化劑抗氧化性能常用的方法。螯合率愈大，被評價的抗氧化劑潛在的抗氧化性就愈強。圖7表明了3種物質對鐵螯合能力的情況，說明3者在一定范圍內都有劑量依賴性，EDTA具有極好的鐵螯合能力，在質量濃度為0.1mg/mL時，螯合率為(94.6±1)%，而GCTL1、VC達到50%的螯合率時的質量濃度為(0.180±0.04)、(0.405±0.02)mg/mL，說明GCTL1對鐵的螯合力雖不及EDTA，但對鐵離子具有一定的螯合能力，而且在所測濃度范圍內具有劑量依賴性。據(jù)報道在2.4mg/mL時，藥用真菌的甲醇萃取物，如G. Lucidum、Ganoderma antler、Ganoderma tsugae鐵螯合能力為44.8%～67.7%[17]，所以GCTL1可能是靈芝中螯合鐵的一個關鍵成分。

有關GCTL1抗氧化的機理尚不清楚。圖8是GCTL1的結構示意圖[8]。在其結構中，3位碳上有一個活波氫，可以給出一個質子，苷元結合的糖基上的羥基也可能提供質子，參與清除自由基的作用。另外3位的羥基和11位的羰基可能與金屬離子發(fā)生絡合作用。但具體的抗氧化機理還需要進一步進行研究。

圖8 GCTL1的結構Fig.8 Structure of GCTL1

3 結 論

對從靈芝發(fā)酵液中分離獲得的GCTL1的抗氧化作用進行研究。研究表明，GCTL1具有清除超氧陰離子自由基、羥自由基、過氧化氫自由基，DPPH自由基的作用，另外其還有螯合鐵離子及還原力的作用，其清除超氧陰離子自由基、羥自由基、DPPH自由基、過氧化氫自由基的清除率的半抑制質量濃度(IC50)分別為：0.247、0.197、0.09、0.279mg/mL；GCTL1的還原力為0.5和鐵螯合力為50%的質量濃度分別是0.425、0.180mg/mL，而且在一定質量濃度范圍內具有劑量依賴效應。與典型的抗氧化劑VC和BHT相比，GCTL1的總體抗氧化能力更好，因而是一種潛在的新型抗氧化劑。由于氧自由基與生物機體的很多疾病有關，如心血管疾病、炎癥、腫瘤等，與衰老也密切相關，因此深入研究GCTL1的抗氧化作用具有重要的應用價值。

[1]趙繼鼎, 張小青. 中國真菌志: 第十卷, 靈芝科[M]. 北京: 科學出版社, 2000.

[2]KO H H, HUNG C F, WANG J P, et al. Anti-inflammatory triterpenoids and steroids from Ganoderma lucidum and G. tsugae[J]. Phytochem, 2008, 69: 234-239.

[3]LAKSHMI B, AJITH T A, NAYANA J, et al. Antimutagenic activity of methanolic extract of Ganoderma lucidum and its effect on hepatic damage caused by benzo[a]pyrene[J]. J of Ethnopharm, 2006, 19: 297-303.

[4]ZHANG J S, TANG Q J, MARTIN Z K, et al. Activation of B lymphocytes by GLIS, a bioactive proteoglycan from Ganoderma lucidum[J]. Life Sci, 2002, 71: 623-638.

[5]MEKKAWY S, MESELHY M R, NAKAMURA N, et al. Anti-HIV-1 and anti-HIV-1 protease substances from Ganoderma lucidum[J]. Phytochem, 1998, 49(6): 1651-1657.

[6]藺麗, 方能虎, 吳旦. 靈芝的主要生物活性研究概況[J]. 中國食用菌, 1998, 21(3): 38-40.

[7]陳若蕓, 于德泉. 靈芝三萜化學成分研究進展[J]. 藥學學報, 1990, 25(12): 940-953.

[8]崔月花, 丁重陽, 章克昌. 一種靈芝三萜皂甙新物質的分離鑒定和結構推斷[J]. 食品與生物技術學報, 2008, 27(3): 60-63.

[9]MARKLUND S, MARKLUND G. Involvement of the superoxide anion radical in the autoxidation of pyrogallol and convenient assay for superoxide dismutase[J]. Eur J Biochem, 1974, 47: 469-474.

[10]崔月花, 徐鵬, 章克昌. 靈芝液態(tài)發(fā)酵有效產物體外抗氧化活性的研究[J]. 食品與發(fā)酵工業(yè), 2006, 32(8): 32-34.

[12]ZHOU Kequan, YU Liangli. Effects of extraction solvent on wheat bran antioxidant activity estimation[J]. Lebensmitte-Wissenschaft und-Technologie, 2004, 37: 717-721.

[13]ZHU Min, CHANG Qi, WONG L K, et al. Triterpene antioxidants from Ganoderma lucidum[J]. Phytother Res, 1999, 13(6): 529-531.

[14]TAKASHI K, MAKIKO T, TOMOKO H. Antioxidant properties of dried kayamo-nori, a brown alga Scytosiphon lomentaria (Scytosiphonales, Phaeophyceae)[J]. Food Chem, 2005, 89: 617-622.

[15]王榆. 人參皂甙對自由基的清除作用[D]. 重慶: 重慶大學, 2003.

[16]MAU J L, LIN H C, CHEN C C. Antioxidant properties of several medicinal mushrooms[J]. J Agri and Food Chem, 2002, 50: 6072-6077.

[17]YAMAGUCHI R, TATSUMI M A, KATO K, et al. Effect of metal salts and fructose on the autoxidation of methyllinoleate in emulsions[J]. Agric Biol Chem, 1988, 52: 849-850.

[18]LUI F, NG T B. Antioxidative and free radical scavenging activities of selected medicinal herbs[J]. J Life Sci, 1999, 66: 725-735.

[19]S ANCHEZ-MORENO C, LARRAURI J A, SAURA-CALIXTO F. A procedure to measure the antiradical efficiency of polyphenols[J]. J Sci Food and Agri, 1998, 76(2): 270-276.

[20]MAU J L, TSAI S Y, TSENG Y H, et al. Antioxidant properties of methanolic extracts from Ganoderma lucidum[J]. Food Chem, 2005, 93: 641-649.

[21]CROSS C E, HALLIWELL B, BORISH E T, et al. Oxygen radicals and human disease[J]. Ann of Inter Med, 1987, 107: 526-545.

Assessment of in vitro Antioxidant Activity of a Triterpenoidal Saponin from Ganoderma lucidum Fruit Bodies

CUI Yue-hua1，ZHANG Ke-chang2
(1. College of Bioscience and Biotechnology, Yangzhou University, Yangzhou 225009, China；2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education, Jiangnan University, Wuxi 214122, China)

To assess the in vitro antioxidant activity of a triterpenoidal saponin from Ganoderma lucidum, named GCTL1, GCTL1 was tested for its abilities to scavenge superoxide anion, hydroxyl, DPPH and hydroxyl peroxide free radicals, reducing power and ferric-chelating capacity and was compared with BHT and vitamin C, synthetic antioxidants. GCTL1 had interesting antioxidant effect. The IC50values for scavenging superoxide anion, hydroxyl, DPPH and hydroxyl peroxide were (0.247 ± 0.05), (0.197 ± 0.002), (0.09 ± 0.02) mg/mL and (0.279 ± 0.04) mg/mL, respectively, and the concentrations for achieving 0.5 reducing power and 50% ferric-chelating capacity were (0.425 ± 0.01) mg/mL and (0.180 ± 0.04) mg/mL. All these antioxidant properties were dependent on concentration varying in a certain range. Collectively, our findings demonstrate that GCTL1 is better antioxidant than BHT and vitamin C.

Ganoderma lucidum；triterpenoidal saponins；antioxidant activity；scavenging activity

Q946.83

A

1002-6630(2010)19-0049-05

2010-01-25

揚州大學博士科研啟動基金項目

崔月花(1971—)，女，講師，博士，研究方向為發(fā)酵工程。E-mail：yhcui@yzu.edu.cn