鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究

王運改，林 琳，李明輝，翁世兵，葉應旺，姜紹通，陸劍鋒*

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

鮰魚皮明膠抗氧化肽的制備工藝研究

王運改，林 琳，李明輝，翁世兵，葉應旺，姜紹通，陸劍鋒*

(合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009)

通過測定鮰魚皮明膠蛋白酶解物對Fenton體系產生的羥自由基的清除效果，篩選得出胰蛋白酶和胃蛋白酶酶解物具有較高的清除羥自由基(·OH)的活性；用正交試驗L9(34)對胰蛋白酶的水解條件進行優(yōu)化，確定最佳的水解條件為溫度40℃、pH7.5、酶與底物質量濃度比(E/S)3.5%、底物質量濃度2.5g/100mL、酶解時間3h。此外，本研究還采用胰蛋白酶和胃蛋白酶進行了復合酶解試驗，確定復合酶解的最佳水解條件為先用胰蛋白酶酶解3h，然后用胃蛋白酶酶解3h，此時得到的酶解液自由基清除率最高，達到47.38%。

鮰魚；酶解；活性肽；羥自由基

明膠廣泛應用于工業(yè)領域，如食品工業(yè)、材料工業(yè)、制藥工業(yè)等。研究表明，明膠多肽具有多方面的生理功能[1]，如：蛋白質消化吸收率幾乎達到100%；保護胃黏膜以及抗?jié)冏饔?；抑制血壓上升作用；促進骨形成作用；促進皮膚代謝(美容效果)；膠原多肽還對關節(jié)炎等膠原病具有很好的預防及治療作用。

長期以來，人們都是使用豬、牛的皮和骨提取膠原蛋白和明膠。但隨著瘋牛病(BSE)、口蹄疫(FMD)等牲畜疾病的爆發(fā)，使人們對牲畜膠原制品安全性產生疑慮[2]。另外，由于宗教和習俗等原因，有些地區(qū)也不能使用牲畜膠原蛋白制品，因此尋找豬、牛皮和骨以外的明膠原料制備明膠和相關制品成為當務之急，而水產加工廢棄物(如魚皮、魚骨和魚鱗等)就成為最理想和現(xiàn)實的替代原料[3]。隨著世界各國水產加工業(yè)的發(fā)展，產生越來越多的水產廢棄物，結合研究的不斷深入，目前人們已經能從魚皮、魚骨和魚鱗等廢棄物中提取明膠加以利用，這不僅可以促進水產加工廢棄物的綜合利用、提高產值，而且還可以減少對環(huán)境的污染。

自由基是一類具有高度活性的物質，可以在細胞代謝過程中不斷地產生，它可直接或間接地發(fā)揮強氧化作用，廣泛地參與機體的生理與病理過程[4]。生物體內最有害的自由基為羥自由基，可以對活細胞內的生物分子造成極大的危害[5]。本研究采用生物技術手段對斑點叉尾鮰(Ictalurus punctatus)魚皮明膠進行酶解，得到具有清除羥自由基作用的蛋白質水解物，該水解物可以作為具有抗衰老活性的功能性食品和化妝品進行開發(fā)利用，并為進一步的工業(yè)化生產提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮰魚皮由安徽省明光市永言水產(集團)有限公司提供，清洗后于－20℃冷藏。

胃蛋白酶(≥1200U/g)、胰蛋白酶(≥1200U/g) 國藥集團化學試劑有限公司；木瓜蛋白酶(80萬U/g生物酶制劑)、堿性蛋白酶(≥5萬U/g)、中性蛋白酶(20萬U/g)南寧龐博生物工程有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

721分光光度計 上海第三分析儀器廠；CT15RT高速冷凍離心機 上海天美生化儀器設備有限公司；JJ-1型定時電動攪拌器 江蘇金壇市金城國盛實驗儀器廠；旋渦混合器 Barloworld Scientific公司；PHS-3C精密pH計 上海大普儀器有限公司；電子分析天平 上海民橋精密科學儀器有限公司；HH-2孔數(shù)顯水浴鍋 江蘇金壇環(huán)宇科學儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 鮰魚皮基本成分的測定

水分含量測定：直接干燥法，參照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的測定》；灰分測定：灼燒稱質量法，參照GB/T5009.4—2003《食品中灰分的測定》；粗蛋白測定：凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2003《食品中蛋白質的測定》；粗脂肪測定：索氏抽提法，參照GB/T 5009.6—2003《食品中脂肪的測定》；膠原蛋白含量測定：通過測定羥脯氨酸含量換算鮰魚皮中的膠原蛋白含量[6-7]。

羥脯氨酸含量測定：稱量約5mg魚皮(干基)置于安瓿瓶中，加入1mL 6mol/L的HCl，在酒精噴燈上封管，放入130℃的電熱鼓風干燥箱中，水解3h，水解后的液體經稀釋，移入250mL容量瓶中定容。吸取上述稀釋液4mL于具塞試管中，加入氯胺T溶液2mL，搖勻后于室溫放置氧化20min，加入10g/100mL對二甲基氨基苯甲醛2mL，搖勻，塞上塞子于60℃恒溫水浴中保溫20min，保溫后迅速用流動的冷水冷卻至室溫，在波長(558±2)nm處測定吸光度，記錄數(shù)值。由羥脯氨酸標準曲線得到相應吸光度的羥脯氨酸含量，則膠原蛋白含量按下列公式計算：

1.3.2 鮰魚皮明膠的提取

稱取一定量的魚皮，剪成小塊，按料液比1:6的比例用體積分數(shù)10%正丁醇浸泡1d(脫脂)，然后加0.05mol/L NaOH溶液(料液比為1:6)浸泡30min，水洗至中性，再加質量分數(shù)0.2%硫酸溶液(料液比為1:6)浸泡30min，水洗至中性，最后用熱水抽提過夜，4000r/min離心20min，棄去沉淀不溶物，得到粗膠制品，于冷凍干燥機中凍干[8]。

1.3.3 鮰魚皮明膠水解工藝

稱取制備的明膠，用100mL(相應pH值)磷酸鹽緩沖液溶解制成相應濃度的明膠溶液，以此為底物。按照試驗設計調節(jié)恒溫水浴鍋至所需溫度，按水解所需加酸(HCl)或堿(NaOH)達到預定的pH值，加入一定量的酶進行水解，水解時間為所設時間。水解過程中用電動攪拌機不斷攪拌，水解達到預定時間后，沸水浴中滅酶活10min，終止水解反應，然后迅速冷卻至室溫，置于離心機中，以4000r/min離心15min，傾倒出上清液，取上清液2mL稀釋到50mL，然后測定其水解度和清除羥自由基的活性。

1.3.4 水解度測定

采用茚三酮方法[9]。

1.3.5 水解物對羥自由基(·OH)清除能力的測定[10]

向試管中加入樣品溶液1.00mL 1.8mmol/L FeSO4溶液2.00mL，1.8mmol/L水楊酸-乙醇 1.50mL，最后加體積分數(shù)0.03% H2O2溶液 0.10mL啟動反應，振蕩混合，水浴37℃保溫30min，以蒸餾水調零在波長為510nm處測量各自的吸光度。自由基清除率(D)計算公式為：

式中：A0為以蒸餾水代替樣品液的吸光度；AS為加入樣品液后的吸光度。

1.4 工藝優(yōu)化

分別選用5種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶)，對魚皮明膠進行水解，測定水解物的羥自由基清除活性，選取水解作用較強的酶，對其水解條件進行優(yōu)化，確定制備具有較高羥自由基清除活性的水解物的最佳水解工藝條件。然后選取清除羥自由基活性較高的兩種酶進行復合水解，確定復合水解的最佳工藝條件。表1所示為5種酶酶解的最適條件。

表1 5種酶的酶解條件Table 1 Optimal reaction conditions of five enzymes

2 結果與分析

2.1 鮰魚皮基本成分

表2 鮰魚皮的基本成分Table 2 Basic chemical composition of channel catfish skin

由表2可知，干鮰魚皮中的主要成分為蛋白質，經測定和計算可知，干鮰魚皮中的膠原蛋白含量為55.32%，占總蛋白質含量的61.93%，所以膠原蛋白是魚皮中主要蛋白質。此結果表明鮰魚皮可以作為一種很好的提取明膠的原料。鮰魚皮中脂肪含量較高，達到8.83%，所以在提取明膠時采用10%正丁醇按照料液比1:6的比例浸泡1d以去除大部分脂肪。

2.2 水解用酶的篩選

選用5種蛋白酶(胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶)在其酶活力最高的條件下對鮰魚皮明膠水解4h(表2)，測定水解物的羥自由基清除率，實驗結果見圖1。

圖1 不同蛋白酶水解魚皮明膠得到的水解液清除羥自由基活性的比較Fig.1 Comparison of hydroxyl free radical scavenging activity of hydrolyzed channel catfish skin gelatin with different enzymes

由圖1可知，經過蛋白酶的水解作用，鮰魚皮明膠水解液的清除羥自由基的能力均顯著的提高。從這5種酶的清除羥自由基效果看，胃蛋白酶和胰蛋白酶作用后的水解液對羥自由基的清除能力提高最大，因此選擇這兩種酶作為酶解鮰魚皮明膠蛋白用酶。

2.3 胰蛋白酶酶解工藝條件優(yōu)化

2.3.1 酶解時間的確定

在不同水解時間(1、2、3、4、5、6h)內水解鮰魚皮明膠，并測定其水解液清除羥自由基的能力大小。由圖2可知，隨著水解時間的延長，水解液清除羥自由基的能力不斷增強。在最初1h內水解液對羥自由基清除能力的增加幅度較大，1h為19.1%；當水解時間達到3h左右，水解液清除羥自由基的能力由2h時的24.15%上升到31.78%，達到最高；繼續(xù)延長水解時間，水解物的羥自由基清除率基本無顯著提高，因此從生產角度考慮，3h是制備具有羥自由清除活性多肽的較適水解時間。

圖2 酶解時間對羥自由基清除率的影響Fig.2 Effect of hydrolysis duration on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

2.3.2 酶解pH值的確定

圖3 酶解pH值對羥自由基清除率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis pH on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖3可知，在水解溫度為45℃、酶與底物質量濃度比為4%、底物質量濃度為1g/100mL、酶解時間為3h的條件下，分別在pH7、7.5、8、8.5、9時酶解，清除率分別為38.04%、39.1%、36.99%、35.47%、35.12%。pH值為7.5時，清除率達到最大。

2.3.3 酶解溫度的確定

圖4 酶解溫度對羥自由基清除率的影響Fig.4 Effect of hydrolysis temperature on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖4可知，在酶與底物質量濃度比為4%、pH值為7.5、底物質量濃度為1g/100mL，酶解時間為3h條件下，分別在35、40、45、50、55℃時酶解，清除率分別為22.79%、27.19%、27.8%、26.35%、23.61%。清除率隨著溫度的升高而增大，在45℃左右，清除率最高，隨后又隨著溫度的上升而下降。在較低溫度下，酶作用微弱，溫度升高催化能力加大，超過最適溫度后反應速度下降，并伴隨溫度升高酶逐漸變性，清除率下降[11]。

2.3.4 酶與底物質量濃度比的確定

圖5 酶與底物質量濃度比對羥自由基清除率的影響Fig.5 Effect of enzyme/substrate ratio on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖5可知，在pH7.5、溫度為45℃、底物質量濃度為1g/100mL，酶解3h的條件下，分別在酶與底物質量濃度比(E/S)為1%、2%、3%、4%時酶解，清除率分別為29.4%、34.8%、36.87%、36.73%、36.91%。隨著酶與底物質量濃度比的增加，羥自由基清除率逐漸增加，酶與底物質量濃度比增加到一定程度時，清除率不再增加，其可能原因是隨著酶質量濃度增加到一定程度，底物達到飽和，酶促反應速度不再增加。所以從實驗成本方面考慮，選取3%為最佳的酶與底物質量濃度比，即酶與底物質量濃度比為3%進行水解反應，制備具有清除羥自由基能力的活性多肽。

2.3.5 底物質量濃度的確定

圖6 底物質量濃度對羥自由基清除率的影響Fig.6 Effect of substrate concentration on the hydroxyl free radical scavenging rate of hydrolyzed channel catfish skin gelatin

由圖6可知，在酶與底物質量濃度比為3%、溫度為45℃、pH值為7.5，酶解時間為3h時，分別在底物質量濃度為1、2、3、4g/100mL時酶解，清除率分別為36.87%、44.69%、42.55%、40.06%。隨著底物質量濃度的增加，清除率逐漸升高，底物質量濃度為2g/100mL時清除率最高，隨著底物質量濃度的繼續(xù)升高，清除率反而出現(xiàn)下降，其可能原因是隨著體系中的水分減少，影響了酶促反應的進行，所以底物質量濃度選擇2g/100mL為宜。

2.3.6 最佳水解條件的確定

在上述單因素試驗的基礎上，綜合考慮各因素作用，以溫度、pH、底物質量濃度、酶與底物濃度比為主要因素，以羥自由基清除率為指標，采用正交設計確定最佳反應條件。正交試驗因素水平見表3，試驗結果及方差分析見表4。

表3 胰蛋白酶的正交試驗因素與水平Table 3 Factors and levels in the orthogonal array design L9(34)

表4 正交試驗因素及水平Table 4 Orthogonal array design matrix and experimental results

由表4可知，以水解液對對羥自由基的清除率為評價指標，對正交試驗結果進行極差分析，極差由大到小的順序是B＞C＞A＞D，即溫度對清除率的影響最大，pH值次之，其次分別是加酶量和底物質量濃度。根據(jù)正交試驗結果分析，鮰魚皮膠原蛋白酶解物清除羥自由基的最佳條件為A3B1C2D3，即確定鮰魚皮膠原蛋白酶解物清除羥自由基的最佳條件為酶與底物質量濃度比為3.5%、溫度40℃、pH7.5、底物質量濃度為2.5g/100mL。同時，對各組正交試驗所得水解物的水解度進行測定。水解液的羥自由基清除率和水解度沒有相關性，水解度高時，水解物的自由基清除率并不一定高。

2.4 復合酶解條件的確定

由于蛋白酶對肽鍵作用具有一定的專一性，采用單酶水解時，只能從幾個固定的氨基酸殘基進行水解，水解程度受到限制，為了得到更小分子質量的水解產物，采用組合酶解是一種必然的趨勢。組合酶解切斷肽鍵的位置不同，所以用兩種或者兩種以上的酶組合制備水解液，有可能進一步降低產物的分子質量，得到分子質量合理分布的水解液[12]。選取兩種能夠制備高清除羥自由基活性的酶A(胰蛋白酶)和B(胃蛋白酶)，進行復合酶解實驗，分6組進行實驗，各組的具體實驗條件見表5，實驗結果見圖7。

表5 單酶與復合酶水解的比較Table 5 Conditions for the hydrolysis of channel catfish skin gelatin with pepsin, trypsin and both of them in different orders of addition

圖7 復合酶水解膠原蛋白多肽組分對水解度和羥自由基抑制率的影響Fig.7 Comparisons of degree of hydrolysis and hydroxyl free radical scavenging rate obtained using different hydrolysis protocols

由圖7可知，胰蛋白酶和胃蛋白酶復合酶解的工藝(即G3組實驗)得到的水解產物清除羥自由基能力最強(49.92%)，但其水解度僅為6.47%；而先用胰蛋白酶然后用胃蛋白酶酶解的工藝(即G1組試驗)清除自由基的能力也很強(47.38%)，且其水解度高達12.11%。由此可見，組合酶技術在制備高活力水解液上應用是可行的，采用復合酶解的方法能夠有效提高水解效果，尤其適用于制備清除自由基能力更高的多肽產物。

3 結 論

鮰魚皮明膠經過酶解之后產生多肽，多肽具有清除羥自由基的活性。胰蛋白酶水解鮰魚皮明膠的最佳水解條件為溫度40℃、pH7.5、酶與底物質量濃度比3.5%、底物質量濃度2.5g/100mL，酶解時間3h。水解液在胰蛋白酶最佳水解條件下水解3h之后，再經胃蛋白酶最適水解條件水解3h之后、得到的羥自由基清除率最高，達到47.38%。以上研究表明，鮰魚皮明膠多肽對自由基有一定的清除作用，為開發(fā)具有抗衰老活性的功能性食品和化妝品提供理論和技術支持。

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Enzymatic Preparation of Antioxidant Peptides from Channel Catfish (Ictalurus punctatus) Skin Gelatin

WANG Yun-gai，LIN Lin，LI Ming-hui，WENG Shi-bing，YE Ying-wang，JIANG Shao-tong，LU Jian-feng*
(College of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

Five enzyme preparations were solely used to hydrolyze channel catfish (Ictalurus punctatus) skin gelatin and pepsin and trypsin were screened for further studies in view of higher hydroxyl free radical scavenging activity of the hydrolysates. Optimization of the conditions for trypsin hydrolysis was carried out using orthogonal array design L9(34) and the optimal hydrolysis conditions were determined as follows: temperature 40 ℃; pH 7.5; enzyme/substrate ratio (E/S) 3.5%; substrate concentration 2.5 g/100mL; and hydrolysis duration 3 h. In addition, pepsin and trypsin were used together for the two-step hydrolysis of channel catfish gelatin in different orders of addition or one-step hydrolysis, namely adding the two enzymes simultaneously. Initial trypsin hydrolysis for 3 h followed by another 3 h of pepsin hydrolysis resulted in the generation of peptides with the highest hydroxyl free radical scavenging rate, up to 47.38%.

channel catfish (Ictalurus punctatus)；enzymatic hydrolysis；bioactive peptides；hydroxyl free radical

TS254.1

A

1002-6630(2010)19-0254-05

2010-06-30

安徽省重大科技攻關專項(08010301078)；國家星火計劃項目(2008GA710021)；安徽省自然科學基金項目(090411018)；安徽高校省級自然科學研究重點項目(KJ2009A106)；國家自然科學基金項目(31000832)

王運改(1985—)，女，碩士研究生，主要從事食品資源綜合利用研究。E-mail：wangyungai@126.com

*通信作者：陸劍鋒(1976—)，男，副研究員，博士，主要從事水生動物資源的保護和綜合利用研究。E-mail：Lujf@sibs.ac.cn