曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

林健輝，黃曼曼，陳雪香，王 征，肖蘇堯，曹 庸,*

曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶培養(yǎng)條件優(yōu)化

林健輝1，黃曼曼1，陳雪香1，王 征2，肖蘇堯1，曹 庸1,*

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510640；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410128)

以通過60Co誘變得到的曲霉T3-5-1為實驗菌株，通過單因素與正交試驗，對其產(chǎn)單寧酶的條件進行研究。結(jié)果表明：以β-環(huán)糊精為碳源、蛋白胨為氮源、培養(yǎng)基初始pH值為5.5、單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、接菌量為5%、搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速120r/min、250mL三角錐瓶中裝液50mL培養(yǎng)基、培養(yǎng)溫度30℃的培養(yǎng)條件為曲霉T3-5-1的最佳產(chǎn)單寧酶條件。在此條件下，曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶比活力達到202.16U/mL，比優(yōu)化前提高約4倍。

曲霉；單寧酶；條件優(yōu)化

單寧酶(EC3.1.1.20)全稱單寧酰基水解酶(tannin acyl hydrolase)，為胞內(nèi)酶，在黑曲霉、米曲霉及酵母等微生物中均已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，是一種誘導(dǎo)酶[1-6]。單寧酶用途廣泛，既可以水解五倍子單寧生成沒食子酸，也可以催化沒食子酸和丙醇合成沒食子酸丙酯[7]；它還能水解茶葉中的酯型兒茶素制備兒茶素單體。另據(jù)報道，單寧酶還可作為食品添加劑和用于開發(fā)茶飲料等[8]。在茶飲料生產(chǎn)過程中，主要存在有三大技術(shù)難點：渾濁沉淀的產(chǎn)生、湯色的褐變[9]和香氣的惡化。其中，渾濁沉淀的產(chǎn)生是最關(guān)鍵的問題所在[10]。在茶飲料生產(chǎn)過程中，由于茶湯中多酚類、咖啡堿、蛋白質(zhì)等通過分子間氫鍵與疏水作用形成絡(luò)合物，可在低溫時沉淀，形成“冷后渾”。沉淀的出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了茶飲料的感官品質(zhì)和可溶物總量，因此需要采用物理、化學(xué)[11]或酶法來解決。單寧酶作為酶促專溶酶，能斷裂兒茶酚與沒食子酸之間的酯鍵，使苦澀味的酯型兒茶素水解，釋放出的沒食子酸陰離子又能與茶黃素、茶紅素競爭咖啡堿，形成分子質(zhì)量較小的水溶性短鏈物質(zhì)，從而降低茶湯的渾濁度[12-13]。

近年來，隨著茶飲料工業(yè)的迅猛發(fā)展，單寧酶的研究日益受到各國的關(guān)注和重視。目前，單寧酶的產(chǎn)量不高，因此，大量的研究工作都是圍繞如何提高單寧酶的產(chǎn)量展開的。本研究以通過60Co誘變得到的曲霉T3-5-1為出發(fā)菌，對其產(chǎn)單寧酶的條件進行研究，旨在提高單寧酶的酶活力，為今后制備單寧酶提供更優(yōu)化的產(chǎn)酶條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

曲霉菌株T3-5-1由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院天然活性物研究中心在五倍子中分離并經(jīng)60Co輻照誘變篩選得到。

1.1.2 試劑

沒食子酸丙酯、單寧酸、蔗糖、硝酸鈉、磷酸氫二鉀、氯化鉀、硫酸鐵、硫酸鎂溴酚藍、檸檬酸、檸檬酸鈉均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基(g/L)：蔗糖30、硝酸鈉3、磷酸氫二鉀1、氯化鉀0.5、硫酸鐵0.01、硫酸鎂0.5；基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：單寧酸20、蔗糖10、硝酸鈉3、磷酸氫二鉀1、氯化鉀0.5、硫酸鐵0.01、硫酸鎂0.5。

1.2 儀器與設(shè)備

SE-CJ-27-D超凈工作臺 蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；恒溫搖床 沈陽龍騰電子有限公司；手提式高壓滅菌鍋 濱江醫(yī)療設(shè)備廠；紫外-可見分光光度計 上海科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 曲霉T3-5-1的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

將曲霉T3-5-1接種于斜面培養(yǎng)基斜面上，30℃培養(yǎng)，待孢子成熟后，用適量的生理鹽水將孢子洗下于裝有玻璃珠的三角錐瓶中，30℃振蕩培養(yǎng)1～2h，使孢子充分分散。取1mL孢子懸液進行梯度稀釋并鏡檢計數(shù)[14]，調(diào)整孢子密度至106個/mL。

在250mL的錐形瓶中裝入50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，接種1mL曲霉孢子懸液于30℃，120r/min振蕩培養(yǎng)72h。

1.3.2 單寧酶的提取及酶活力測定[15]

1.3.2.1 粗酶液的提取

發(fā)酵懸浮液經(jīng)濾紙過濾后得到菌絲體。蒸餾水洗至pH值中性，于冰箱中預(yù)冷。將菌絲體、石英砂、0.1mol/L pH5.0檸檬酸緩沖液按1:1:4(m/m/V)的比例在冰浴下研磨成漿，0～4℃下10000r/min離心30min。取上清液，用緩沖液定容至10mL，即得單寧酶粗酶液。

1.3.2.2 單寧酶活力的測定

準(zhǔn)備1支對照管、1支空白管和3支測定平行管。首先在每支試管中各加入0.2mL酶液，然后在測定管中各加入0.2mL底物沒食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(2×10-3mol/L)，在空白管中加入0.2mL 0.1mol/L pH5.0檸檬酸緩沖液，在對照管中加入0.6mL無水乙醇，準(zhǔn)確反應(yīng)20min后，分別在測定管和空白管中加入0.6mL的無水乙醇(終止測定管中的反應(yīng))，在對照管中加入0.2mL底物沒食子酸丙酯標(biāo)準(zhǔn)溶液。待反應(yīng)液冷卻后，再分別在各支試管中加入9mL緩沖液稀釋，測定波長270nm下吸光度。單寧酶酶活力的定義：反應(yīng)溫度45℃，pH5.0的條件下，酶液每小時水解減少0.01μmol底物沒食子酸定義為一個酶活力單位(U)。

1.3.3 產(chǎn)酶發(fā)酵條件的單因素試驗

1.3.3.1 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)單寧酸對單寧酶比活力的影響

50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的單寧酸分別配制成1%、2%、3%、4%、5%，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定單寧酶比活力。

1.3.3.2 不同種類碳源對單寧酶比活力的影響

50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的蔗糖分別替換成等質(zhì)量分?jǐn)?shù)的葡萄糖、β-環(huán)糊精、淀粉、麥芽糖，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定單寧酶比活力。

1.3.3.3 不同種類氮源對單寧酶比活力的影響

50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的硝酸鈉分別替換成等質(zhì)量濃度的硝酸銨、蛋白胨、豆餅粉、玉米粉，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定單寧酶比活力。

1.3.3.4 培養(yǎng)基不同初始pH值對單寧酶比活力的影響

50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH值分別調(diào)成4、5、6、7、8，其余組分不變，接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定單寧酶比活力。1.3.3.5不同培養(yǎng)溫度對單寧酶比活力的影響

50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1mL曲霉孢子懸液，120r/min振蕩培養(yǎng)，分別控制溫度25、28、30、33、35℃，72h后測定單寧酶比活力。

1.3.3.6 不同溶氧量對單寧酶比活力的影響

在菌種搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)過程中，可通過改變培養(yǎng)基的裝液量和搖床轉(zhuǎn)速來控制搖瓶中的溶氧量。分別在裝有30、40、50、60、70mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1mL曲霉孢子懸液，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定單寧酶比活力。

裝有50mL的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種1mL曲霉孢子懸液，30℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速分別控制在100、120、140、160、180r/min，72h后測定單寧酶比活力。

1.3.3.7 不同接種量對單寧酶比活力的影響

50mL基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中接種量為3%、4%、5%、6%、7%，30℃、120r/min振蕩培養(yǎng)72h，測定單寧酶比活力。

1.3.4 產(chǎn)酶發(fā)酵條件的正交試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選擇對產(chǎn)酶影響較大的各個因素，進行正交試驗，綜合分析各個因素及其交互作用對產(chǎn)酶發(fā)酵的影響，進而確定最優(yōu)發(fā)酵條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對單寧酶比活力的影響

圖1 不同單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.1 Effect of tannic acid concentration on tannase production

單寧酶是誘導(dǎo)酶，因此在產(chǎn)單寧酶發(fā)酵培養(yǎng)基中必須加入適當(dāng)?shù)恼T導(dǎo)物單寧酸。由圖1可知，當(dāng)誘導(dǎo)物單寧酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時，單寧酶活力最大，為62.33U/mL。

2.2 碳源對單寧酶比活力的影響

圖2 不同碳源對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.2 Effect of carbon source type on tannase production

如圖2所示，β-環(huán)糊精作為碳源可使酶比活力達到最大值116.51U/mL。其他4種碳水化合物所對應(yīng)的酶活力均低于此最大酶比活力，使用蔗糖作為碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基使酶比活力達到50.24U/mL。

2.3 氮源對單寧酶比活力的影響

圖3 不同氮源對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.3 Effect of nitrogen source type on tannase production

如圖3所示，與硝酸鈉作為氮源相比，無機氮源中硝酸銨表現(xiàn)出較低的單寧酶比活力(31.65U/mL)；有機氮源中，蛋白胨表現(xiàn)的單寧酶比活力則顯著提高(80.98U/mL)。

2.4 初始pH值對單寧酶比活力的影響

圖4 初始pH值對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.4 Effect of medium initial pH on tannase production

如圖4所示，培養(yǎng)基初始pH6時，酶比活力可達到最大值47.65U/mL。當(dāng)初始pH值過高(pH7～8)時，菌株產(chǎn)酶能力則受到比較大的抑制。

2.5 培養(yǎng)溫度對單寧酶比活力的影響

圖5 不同培養(yǎng)溫度對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.5 Effect of culture temperature on tannase production

溫度對發(fā)酵產(chǎn)酶過程的影響主要表現(xiàn)在對菌絲生長和代謝途徑中各種酶活性的影響。如圖5所示，當(dāng)溫度控制在30℃時，酶比活力達最大值46.54U/mL。

2.6 溶氧量對單寧酶比活力的影響

圖6 不同裝液量對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.6 Effect of medium volume contained in 250 mL shaking flask on tannase production

如圖6所示，當(dāng)轉(zhuǎn)速(120r/min)恒定，250mL三角瓶裝液量為50mL時，單寧酶比活力最大值可達45.50U/mL；如圖7所示，當(dāng)裝液量(50mL)恒定，轉(zhuǎn)速在120r/min時，獲得酶比活力最大值47.03U/mL。

圖7 不同搖床轉(zhuǎn)速對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.7 Effect of rotational speed of shaking flask on tannase production

2.7 不同接種量對單寧酶比活力的影響

圖8 不同接種量對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶的影響Fig.8 Effect of inoculum size on tannase production

如圖8所示，當(dāng)接種量達到5%時，單寧酶比活力達到最大，為97.32U/mL。

2.8 曲霉產(chǎn)酶條件優(yōu)化的正交試驗

表1 各單因素方差分析Table 1 Analysis of variances for tannase production with eight different culture conditions

對各單因素試驗進行方差分析，結(jié)果如表1所示，單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)、碳源、氮源、初始pH值、以及接種量這5個因素對曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶活力具有極顯著影響，因此選擇這5個因素，每個因素選擇4個水平進行L16(45)正交試驗。正交表設(shè)計見表2。

表2 L16(45)正交試驗因素水平表Table 2 Factors and levels in the orthogonal array design

表3 產(chǎn)酶發(fā)酵條件的正交試驗結(jié)果Table 3 Orthogonal array design layout and experimental results

由表3所示，5個因素影響曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶能力的主次順序為碳源＞氮源＞單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞pH值＞接種量，最優(yōu)正交組合為A2B2C3D2E3，即以蛋白胨為氮源、以β-環(huán)糊精為碳源、培養(yǎng)基初始pH5.5、單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、接種量為5%。

2.9 驗證實驗

碳源為β-環(huán)糊精、氮源為蛋白胨、培養(yǎng)基初始pH 5.5、單寧酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.5%、接種量為5%，搖瓶培養(yǎng)轉(zhuǎn)速120r/min，250mL三角錐瓶中裝液50mL培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度30℃，在此條件下，曲霉T3-5-1產(chǎn)單寧酶比活力達到202.16U/mL。

3 結(jié) 論

本實驗室從植物五倍子中分離出一株產(chǎn)單寧酶的曲霉，然后利用60Co輻照誘變得到一株高產(chǎn)單寧酶菌株T3-5-1。通過單因素試驗和L16(45)正交試驗對其產(chǎn)酶條件進行優(yōu)化，結(jié)果表明，單寧酶的誘導(dǎo)物單寧酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、接種量、培養(yǎng)基初始pH值對菌株產(chǎn)單寧酶活力有很大影響。而溶氧量對菌株產(chǎn)酶活力的影響并不大；此外溫度的影響也不大。菌株T3-5-1利用的碳源、氮源比較廣泛，其中碳源以β-環(huán)糊精最好，氮源以蛋白胨最佳。參考有關(guān)單寧酶產(chǎn)酶條件的研究[14-15]發(fā)現(xiàn)曲霉基本上都傾向于使用植物氮源豆餅粉，但本實驗中的曲霉T3-5-1卻傾向于使用動物性氮源蛋白胨，這與前人的研究結(jié)果有所不同；而在碳源的使用上，曲霉T3-5-1傾向于利用可溶性淀粉β-環(huán)糊精，也與前人的研究結(jié)果不同，這說明不同來源的曲霉，其最優(yōu)產(chǎn)酶條件并不完全一樣。因此對此誘變菌株T3-5-1進行菌種鑒定，以及對其所產(chǎn)的單寧酶進行分離純化及酶學(xué)性質(zhì)研究，比較其與傳統(tǒng)單寧酶是否存在差異，是下一步研究的方向。通過培養(yǎng)條件優(yōu)化，單寧酶比活力達到202.16U/mL，比優(yōu)化前提高約4倍。

[1]IIBUCHI S, MINODA Y, YAMADA K. Studies on tannin acyl hydrolase of microorganisms. Part III. Purification of the enzyme and some properties of it[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(7): 803-809.

[2]IIBUCHI S, MINODA Y, YAMADA K. Hydrolyzing pathway substrate specificity and inhibition of tannin acyl hydrolase of Asp.oryzone No.7 [J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1972, 36(9): 1553-1562.

[3]BARTHOMEUF C, REGERAT F, POURRAT H. Improvement in tannase recovery using enzymatic disruption of mycelium in combination with reverse micellar enzyme extraction[J]. Biotechnology Techniques, 1994, 18(2): 137-142.

[4]FARIAS G M, GORBEA C, EKINS J R, et al. Purification characterization and substrate relationships of the tannase from Cryphonectria parasitica[J]. Physiological and Molecular Plant Pathology, 1994, 44 (1): 51-63.

[5]ADACHI O, WATANABLE M, YAMADA H. Studies on fungal tannase. Part II. Physicochemical properties of tannase of Aspergillus flavus[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(9): 1079-1085.

[6]YAMADA H, ADACHI O, WATANABE M, et al. Formation, purification, and catalytic properties of tannase of Aspergillus flavus[J]. Agricultural and Biological Chemistry, 1968, 32(9): 1074-1078.

[7]刁其玉. 單寧的最新研究動態(tài)[J]. 飼料研究, 1999 (11): 126-129.

[8]瞿燕. 五倍子發(fā)酵工藝及藥理實驗研究[D]. 成都: 成都中醫(yī)藥大學(xué), 2002: 8-9.

[9]嚴(yán)鴻德. 茶葉深加工技術(shù)[M]. 北京:中國輕工業(yè)出版社, 1998: 30-31.

[10]張正竹. 談紅茶茶湯沉淀物的轉(zhuǎn)溶[J]. 中國茶葉, 1996 (2): 34-35.

[11]王元鳳, 王登良, 魏新林. 酶技術(shù)在茶葉深加工中的應(yīng)用研究[J]. 飲料工業(yè), 2000, 3(6): 18-22.

[12]方元超, 趙晉府. 茶飲料生產(chǎn)技術(shù)[M]. 北京: 中國輕工業(yè)出版社, 2001: 26-27.

[13]閻守和. 速溶茶生物化學(xué)[M]. 北京: 北京大學(xué)出版社, 1990: 97-119.

[14]郭魯宏, 楊順楷. 單寧酶產(chǎn)生菌的篩選和發(fā)酵條件的研究[J]. 應(yīng)用與環(huán)境生物學(xué)報, 1998, 4(4): 386-389.

[15]王征, 謝達平, 楊虹琦, 等. 單寧酶活力測定方法的研究[J]. 生物技術(shù), 2000, 10(6): 40-42.

Optimization of Culture Conditions for Producing Tannase by Aspergillus sp.T3-5-1

LIN Jian-hui1，HUANG Man-man1，CHEN Xue-xiang1，WANG Zheng2，XIAO Su-yao1，CAO Yong1,*
(1. College of Food Science, South China Agricultural University, Guangzhou 510640, China；2. College of Bioscience and Biotechnology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China)

The conditions for producing tannase by a strain of Aspergillus sp.T3-5-1, which was derived from60Co-induced mutation, were optimized using single factor and orthogonal array design methods. The optimal carbon source, nitrogen source, medium initial pH, tannic acid concentration, inocumlum size, rotational speed of shaking flask, medium volume contained in 250 mL shaking flask and culture temperature were β-cyclodextrin, peptone, 5.5, 3.5%, 5%, 120 r/min, 50 mL /250 mL and 30 ℃, respectively. The maximum tannase activity was up to 202.16 U/mL under these conditions, approximately 4-fold higher than before optimization.

Aspergillus；tannase；optimization of culture conditions

TQ925

A

1002-6630(2010)19-0245-05

2009-12-23

林健輝(1984—)，男，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：jianhuilcn@126.com

*通信作者：曹庸(1966—)，男，教授，博士，研究方向為天然活性物的提取、分離純化。E-mail：caoyong2181@scau.edu.cn