鴨肝谷氨酸脫氫酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

朱 鴻，李想韻，王 松，付偉麗，唐靚婷，誥趙偉，唐云明*

鴨肝谷氨酸脫氫酶的純化與酶學(xué)性質(zhì)研究

朱 鴻，李想韻，王 松，付偉麗，唐靚婷，誥趙偉，唐云明*

(西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，三峽庫(kù)區(qū)生態(tài)環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶市甘薯工程研究中心，重慶 400715)

目的：獲得鴨肝谷氨酸脫氫酶純品并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行研究。方法：采用丙酮脫脂、重金屬離子沉淀、硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠層析方法，分離純化鴨肝谷氨酸脫氫酶，用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法進(jìn)行純度鑒定和酶相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定。結(jié)果：從鴨肝中分離純化獲得電泳純的谷氨酸脫氫酶，純化倍數(shù)為60.93倍，酶活力回收率為11.02%，比活力達(dá)24.37U/mg。酶相對(duì)分子質(zhì)量為371.41，亞基相對(duì)分子質(zhì)量為61.60。推測(cè)該酶由6個(gè)相同亞基構(gòu)成。該酶對(duì)NADH的Km為53.19μmol/L，最適pH值為10.0，最適反應(yīng)溫度為35℃。該酶在pH8.0左右較穩(wěn)定；在40℃以下酶活力保持穩(wěn)定。Zn2+、Li+和Cu2+對(duì)該酶具有顯著的抑制作用。結(jié)論：分離純化獲得谷氨酸脫氫酶，該酶具有較高應(yīng)用價(jià)值。

鴨肝；谷氨酸脫氫酶；分離純化；性質(zhì)

谷氨酸脫氫酶(glutamate dehydrogenase，GDH)可逆催化谷氨酸脫氨生成α-酮戊二酸和氨，是一種依賴(lài)NAD(P)的脫氫酶[1]。也是是生物體內(nèi)谷氨酸生物合成的一種重要酶[2]。自20世紀(jì)60年代以來(lái)已經(jīng)有不同來(lái)源的GDH得到分離純化和研究[2-5]。Britton等[6]證明GDH主要以六聚體和四聚體形式存在，并且具有相同的亞基。該酶在化學(xué)分析，醫(yī)藥衛(wèi)生等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用[7]。

GDH廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中[8]。但目前還存在依賴(lài)進(jìn)口，酶源窄，成本高，價(jià)格昂貴等不足，因此尋找一種廉價(jià)的酶源是市場(chǎng)降低成本的需要。本實(shí)驗(yàn)以來(lái)源廣泛的鴨肝為原料對(duì)GDH進(jìn)行分離純化和酶學(xué)性質(zhì)研究，為谷氨酸脫氫酶的進(jìn)一步研究和應(yīng)用提供參考，也為該酶的獲得開(kāi)辟一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

家鴨(Anas platyrhynchos)肝臟取自健康活鴨，殺死后立即取肝臟于－20℃冰箱中冰凍保存?zhèn)溆谩?/p>

牛血清白蛋白、NADH、ADP 美國(guó)Sigma公司；DEAE-Sepharose、Sephacryl S-200、分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)品GE公司；三羥甲基氨基甲烷 Farco公司；蛋白質(zhì)SDSPAGE標(biāo)準(zhǔn)品、Marker(MM0900) Genscript公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、丙烯酰胺、甲叉-雙丙烯酰胺 Fluka公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

3704型高速冷凍離心機(jī) 日本玖保田公司；UV-2102 PC型分光光度計(jì) 上海尤尼柯儀器有限公司；N355制冰機(jī) 意大利Icematic公司；Bio-spemini型蛋白核酸分析儀 日本島津公司；DYY-Ⅱ型電泳儀 北京六一公司、PHS-32W微電路pH計(jì) 上海理達(dá)公司；F-20S冷凍干燥儀 日本Nihon公司；BSZ-2型自動(dòng)雙蒸餾水儀上海博通公司；Mill-Q plus超純水儀 美國(guó)Millipore公司；Powerlook 2100XL凝膠掃描儀 臺(tái)灣Umax公司；AKTA prime plus蛋白質(zhì)純化系統(tǒng) GE公司。

1.3 方法

1.3.1 丙酮干粉的制備

稱(chēng)取新鮮鴨肝50g，用自來(lái)水洗凈，再用雙蒸水清洗數(shù)次。剪碎，然后以1:10(m/V)的比例加入經(jīng)－20℃預(yù)冷的丙酮，勻漿后抽濾脫脂得濾餅。兩次丙酮脫脂后將濾餅冷凍干燥至質(zhì)量恒定。研磨成干粉備用。

1.3.2 粗提液的制備

將丙酮干粉以1:20(m/V)的比例加入已經(jīng)預(yù)冷的0.05mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液。勻漿后，4℃冰箱靜置抽提2h，6000×g離心1h，收集上清液即得粗提液。

1.3.3 重金屬離子沉淀

粗提液加入MnCl2溶液使Mn2+終濃度為7mmol/L，4℃冰箱靜置2h后，6000×g離心30min，收集上清液后4℃透析除去Mn2+得粗酶液。

1.3.4 硫酸銨分級(jí)沉淀

粗酶液加入固體硫酸銨至10%飽和度，4℃冰箱靜置2h后，6000×g離心30min，收集上清液。再加入硫酸銨至30%飽和度，4℃冰箱靜置2h，6000×g離心30min，沉淀用0.05mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液溶解，4℃蒸餾水透析過(guò)夜即得到粗酶液。

1.3.5 DEAE-Sepharose離子交換層析

DEAE-Sepharose離子交換柱按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)要求處理。裝柱后，用0.05mol/L、pH8.0 Tris-HCl緩沖液平衡4個(gè)柱體積，粗酶液樣品上DEAE-Sephrose柱(2.6cm× 14cm)，每次上樣為10mL，用0～1.0mol/L線性梯度的NaCl溶液(內(nèi)含0.05mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液)進(jìn)行梯度洗脫，流速30mL/h，每管收集5mL，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為280nm。測(cè)定各管谷氨酸脫氫酶活性和蛋白質(zhì)含量，收集活性較高的各管酶液，4℃透析過(guò)夜，冷凍濃縮后進(jìn)行Sephacryl S-200凝膠層析。

1.3.6 Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾柱層析

Sephacryl S-200凝膠柱按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行裝柱(16mm× 835mm)處理后，每次上樣3mL。用Tris-HCl緩沖液(0.05mol/L、pH8.0)進(jìn)行洗脫，流速18mL/h，每管收集3mL。測(cè)定每管谷氨酸脫氫酶活性和蛋白質(zhì)含量；收集活性較高的各管酶液，4℃透析，冷凍干燥，得到酶純品。

1.3.7 谷氨酸脫氫酶活性測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8]，略有改動(dòng)。利用分光光度法進(jìn)行測(cè)定。分別加入2.465mL 0.08mol/L、pH8.5 Tris-HCl緩沖液，200μL 0.135mol/L α-酮戊二酸，20μL 18mmol/L ADP溶液，200μL 2.85mol/L NH4Cl溶液，100μL酶液，最后加入15μL 30mmol/L NADH溶液，混勻后，在37℃進(jìn)行酶促反應(yīng)，測(cè)定反應(yīng)開(kāi)始1min時(shí)在340nm波長(zhǎng)處的吸光度減少量。在該反應(yīng)條件下，每分鐘催化1μmol NADH氧化所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位。

1.3.8 蛋白質(zhì)含量測(cè)定

采用Lowery法[9]和分光光度法[10]，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.3.9 谷氨酸脫氫酶的純度鑒定

采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行純度鑒定[11]。Marker為重組蛋白復(fù)合物，12%分離膠，5%濃縮，加樣量為10μL。100V電泳10min，180V電泳40min。電泳結(jié)束后取出分離膠用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250染色2h后用脫色液脫色，至蛋白條帶清楚，最后照相分析。

1.3.10 谷氨酸脫氫酶的相對(duì)分子質(zhì)量測(cè)定

采用凝膠過(guò)濾法[12-13]。鴨肝谷氨酸脫氫酶亞基相對(duì)分子質(zhì)量的確定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法測(cè)定[14]。

1.3.11 谷氨酸脫氫酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)測(cè)定

用pH10.0、0.05mol/L Tris-HCl緩沖液配制不同濃度(0.01～0.1mmol/L)的底物溶液，按酶活力測(cè)定方法測(cè)定相應(yīng)的酶活力，根據(jù)Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法[15]求出Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨肝谷氨酸脫氫酶的分離純化

鴨肝谷氨酸脫氫酶粗酶液經(jīng)DEAE-Sepharose柱層析(每管收集5mL)的洗脫圖譜如圖1所示，谷氨酸脫氫酶的活性峰集中在30～34管之間，其中31～33管酶活性最高；分別收集透析冷凍濃縮后再經(jīng)Sephacryl S-200凝膠分子篩柱層析(每管收集3mL)，洗脫圖譜見(jiàn)圖2，谷氨酸脫氫酶活性峰集中在23～29管之間，其中25～27管酶活性最高，分別收集透析冷凍濃縮后備用。整個(gè)純化結(jié)果見(jiàn)表1。最終可得到純化60.93倍，比活力為24.37U/mg，總回收率為11.02%的酶制劑。所得谷氨酸脫氫酶經(jīng)SDS-PAGE鑒定為單一蛋白成分，見(jiàn)圖3，說(shuō)明該酶制劑已達(dá)到電泳純。以該純品為對(duì)象進(jìn)行鴨肝谷氨酸脫氫酶性質(zhì)研究。

圖1 DEAE-Sepharose離子交換層析圖譜Fig.1 DEAE-Sepharose ion-exchange chromatographic fractionation of crude GDH

圖2 Sephacryl S-200凝膠層析圖譜Fig.2 Sephacryl S-200 gel permeation chromatographic fractionation of preliminarily purified GDH

圖3 SDS-PAGE電泳圖Fig.3 SDS-PAGE of purified GDH from duck liver

表1 鴨肝谷氨酸脫氫酶的純化Table 1 Separation and purification procedures of GDH from duck liver and corresponding experimental data

2.2 鴨肝谷氨酸脫氫酶的性質(zhì)

2.2.1 鴨肝谷氨酸脫氫酶相對(duì)分子質(zhì)量和亞基相對(duì)分子質(zhì)量

圖4 Sephacryl S-200凝膠過(guò)濾測(cè)定鴨肝谷氨酸脫氫酶相對(duì)分子質(zhì)量Fig.4 Standard curve for determining relative molecular mass of GDH by Sephacryl S-200 gel permeation chromatography

圖5 SDS-PAGE測(cè)定鴨肝谷氨酸脫氫酶亞基相對(duì)分子質(zhì)量Fig.5 Standard curve for determining subunit relative molecular mass of GDH by SDS-PAGE

經(jīng)Sephacryl S-200凝膠柱層析法測(cè)定鴨肝谷氨酸脫氫酶的全酶相對(duì)分子質(zhì)量為371.41，結(jié)果如圖4所示。經(jīng)SDS-PAGE測(cè)定其亞基相對(duì)分子質(zhì)量為61.60，結(jié)果如圖5所示。說(shuō)明鴨肝谷氨酸脫氫酶由6個(gè)相同的亞基組成。

2.2.2 鴨肝谷氨酸脫氫酶的最適反應(yīng)pH值

圖6 pH值對(duì)鴨肝谷氨酸脫氫酶活力的影響Fig.6 Optimal reaction pH of GDH

在pH4.0～11.0的緩沖液中測(cè)定谷氨酸脫氫酶的酶活力。考察谷氨酸脫氫酶催化反應(yīng)的最適pH值范圍。以酶活力最高值為100%，對(duì)不同pH值作圖，結(jié)果見(jiàn)圖6。酶的最適pH值為10.0，pH值在9.0～10.0的范圍內(nèi)谷氨酸脫氫酶的酶活均可達(dá)到最高酶活力的50%以上，超出該范圍酶活急劇下降。

2.2.3 鴨肝谷氨酸脫氫酶在不同pH值下的穩(wěn)定性

圖7 不同pH值下鴨肝谷氨酸脫氫酶的儲(chǔ)存穩(wěn)定性Fig.7 pH stability of GDH

將純化的酶液與pH4.0～10.0的緩沖體系相混合，4℃放置1、2、3、4、5d后，取適量酶液在最佳反應(yīng)條件pH10.0時(shí)測(cè)定酶活力。以酶活力最高值為100%，在不同反應(yīng)pH值環(huán)境下分別測(cè)定酶活力并作圖，結(jié)果見(jiàn)圖7。該酶在所測(cè)pH8.0時(shí)能較好地保持其酶活，5d孵育后，酶活基本保持不變；pH4.0～6.0酶活性迅速下降，2d內(nèi)完全失活，pH9.0～10.0時(shí)，酶活均不穩(wěn)定。表明該酶的酸堿耐受性很弱。

2.2.4 鴨肝谷氨酸脫氫酶的最適反應(yīng)溫度

圖8 溫度對(duì)鴨肝谷氨酸脫氫酶活力的影響Fig.8 Optimal reaction temperature of GDH

分別測(cè)定谷氨酸脫氫酶在20～60℃條件下的酶活力，其他條件不變。以酶活力最高值為100%，在不同反應(yīng)溫度下分別測(cè)定酶活，結(jié)果見(jiàn)圖8，表明該酶的最適溫度在35℃左右。

2.2.5 鴨肝谷氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性

酶液在4～60℃溫度下分別孵育10、30、60、90、120min后測(cè)定酶活力。4℃的酶活力為100%，不同孵育條件下的相對(duì)酶活力見(jiàn)圖9。4、20℃和30℃條件下，酶活力較穩(wěn)定，保溫120min活性保留原有活性的70%以上；但40℃保溫60min酶活力損失50%以上，隨著溫度的升高，酶活力迅速降低，溫度至60℃時(shí)，酶完全失活。表明該酶只在40℃以下具有一定的熱穩(wěn)定性。

圖9 鴨肝谷氨酸脫氫酶的熱穩(wěn)定性Fig.9 Thermal stability of GDH

在－20℃冷凍保存數(shù)月的鴨肝，所提取的谷氨酸脫氫酶活性無(wú)顯著變化，但純酶在－20℃下保存時(shí)迅速失活。實(shí)驗(yàn)還表明，純酶在0.05mol/L、pH8.0的Tris-HCl緩沖液中于4℃可儲(chǔ)存半年，活力無(wú)明顯損失。

2.2.6 鴨肝谷氨酸脫氫酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)性質(zhì)

圖10 谷氨酸脫氫酶的 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖Fig.10 Lineweaver-Burk plot of GDH

用0.01～0.1mmol/L的NADH在pH10.0，35℃條件下，測(cè)定該酶表觀Km，用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)[15]作圖法見(jiàn)圖10，求得該酶的表觀Km和Vm分別為53.19μmol/L和7.09mmol/(L·min)。

2.2.7 金屬離子對(duì)鴨肝谷氨酸脫氫酶活力的影響

圖11 不同鹽離子對(duì)谷氨酸脫氫酶活力的影響Fig.11 Effects of various metal ions on GDH activity

向純化后的鴨肝谷氨酸脫氫酶酶液中，分別加入不同的金屬離子，使其終濃度為10mmol/L。同時(shí)以不加金屬離子的酶液作為對(duì)照，測(cè)定谷氨酸脫氫酶的活力，結(jié)果如圖11所示。10mmol/L Zn2+、Cu2+可顯著抑制該酶活性，Li+、Fe2+、Mg2+對(duì)鴨肝谷氨酸脫氫酶有不同的抑制作用。其他離子對(duì)酶活力影響不明顯。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)丙酮脫脂、重金屬沉淀、硫酸銨分級(jí)沉淀、DEAE-Sepharose離子交換層析和Sephacryl S-200凝膠層析方法，從鴨肝中獲得了總回收率為11.02%，純化倍數(shù)為60.93倍，比活力達(dá)24.37U/mg的谷氨酸脫氫酶制劑，經(jīng)SDS-PAGE鑒定該酶達(dá)到電泳純。

谷氨酸脫氫酶在國(guó)內(nèi)應(yīng)用廣泛，但主要依賴(lài)進(jìn)口。目前我國(guó)不能工業(yè)生產(chǎn)谷氨酸脫氫酶，主要受限于材料成本問(wèn)題。而我國(guó)家禽養(yǎng)殖廣泛，規(guī)模大，鴨肝材料豐富，價(jià)格低廉，是提取谷氨酸脫氫酶的可靠來(lái)源，可有效緩解成本壓力。并且該酶比活高于現(xiàn)市售且價(jià)格昂貴的同類(lèi)產(chǎn)品，具有較好的熱穩(wěn)定性和儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及較高的科研和臨床價(jià)值。因此，研究并開(kāi)發(fā)其應(yīng)用價(jià)值具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

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Separation, Purification and Characterization of Glutamate Dehydrogenase from Duck Liver

ZHU Hong，LI Xiang-yun，WANG Song，F(xiàn)U Wei-li，TANG Liang-ting，GAO Zhao-wei，TANG Yun-ming*
(School of Life Science, Southwest University, Key Laboratory of Eco-environments in Three Gorges Reservoir Region, Ministry of Education, Chongqing Sweetpotato Engineering Research Center, Chongqing 400715, China)

Objective: To obtain high-purity glutamate dehydrogenase (GDH) from duck liver and characterize this enzyme. Methods: Crude GDH solution was obtained from duck liver after acetone defatting, addition of MnCl2for impurity precipitation, ammonium sulfate salting-out and DEAE-Sepharose ion exchange and Sephacryl S-200 gel permeation chromatographic fractionation. Purity identification and relative molecular mass determination were conducted using sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Results: A GDH enzyme of electrophoretic homogeneity was obtained, with a purification fold of 60.93, an activity recovery of 11.02% and a specific activity of 24.37 U/mg. This enzyme had a relative molecular mass of 371.41 and a subunit relative molecular mass of 61.60. It was deduced that this enzyme was composed of the same six subunits. Its apparent Kmtowards NADH was 53.19μmol/L, and the optimal reaction pH and temperature 10.0 and 35 ℃, respectively. This enzyme had excellent stability at around pH 8.0 and at a temperature below 40 ℃. Zn2+, Li+and Cu2+had significant inhibition on this enzyme. Conclusion: A high-purity GDH enzyme has been successfully prepared. This enzyme greatly deserves to be developed and utilized.

duck liver；glutamate dehydrogenase (GDH)；purification；characterization

Q554.9

A

1002-6630(2010)19-0231-05

2010-01-20

重慶市科委科技攻關(guān)項(xiàng)目(CSCT，2004AC1012)

朱鴻(1985—)，男，碩士研究生，主要從事酶與酶工程研究。E-mail：wild-hong@163.com

*通信作者：唐云明(1960—)，男，教授，博士，主要從事酶與酶工程研究。E-mail：tbright@swu.edu.cn