48種中藥材的多種提取方法的提取物抑制內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖的活性研究

陳 龍,劉英學(xué),陳少鵬,陸 鑫,成 浩,宋少江,周國春＊

1沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,沈陽 110016;2中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院,廣州 510663

48種中藥材的多種提取方法的提取物抑制內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖的活性研究

陳 龍1,2,劉英學(xué)2,陳少鵬2,陸 鑫2,成 浩2,宋少江1,周國春2＊

1沈陽藥科大學(xué)中藥學(xué)院,沈陽 110016;2中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院,廣州 510663

采用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、水為溶劑順序或單獨(dú)提取及熱水提取藥材,研究這些提取物對 HUVEC、Bel-7402、A549細(xì)胞增殖的抑制活性,篩選具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖活性的藥材及其提取方法。本文所研究的 48種中藥材的不同提取方法的提取物抑制內(nèi)皮細(xì)胞和癌細(xì)胞增殖的活性結(jié)果表明:41種中藥材都具有一定的抗血管生成和/或抗癌細(xì)胞活性,其中對 HUVEC、Bel-7402和A549細(xì)胞增殖明顯抑制活性 (IC50≤10μg/mL)的藥材分別有 22種、6種和 6種,對 3種細(xì)胞的增殖都有明顯抑制活性 (IC50≤10μg/mL)的藥材有 5種。

中藥材;抑制細(xì)胞增殖;HUVEC;Bel-7402;A-549

無限制增殖是癌細(xì)胞的最基本的特點(diǎn)[1],而無節(jié)制激活血管生成作用是癌細(xì)胞獲得營養(yǎng)和氧氣實(shí)現(xiàn)癌癥發(fā)展及轉(zhuǎn)移的主要病理因素[1-3],因此有效抑制癌細(xì)胞增殖和阻斷腫瘤血管生成作用是抗癌的 2個(gè)主要策略。包括中草藥在內(nèi)的動植物和微生物等是抗癌藥物的重要來源,目前臨床使用的許多抗癌藥物是天然產(chǎn)物或其類似物[4-6]。中草藥在我國有悠久的歷史,最近幾十年里我國中醫(yī)藥工作者已經(jīng)將許多中草藥開發(fā)成為抗癌中草藥而用于各種癌癥治療,這些成果為中草藥在抗癌領(lǐng)域的研究做出了重要貢獻(xiàn)。

為了研究中草藥成分 (物質(zhì)基礎(chǔ))與藥理藥效活性之間的關(guān)系,本文對多個(gè)科屬的 48種中藥材進(jìn)行了多種提取方法提取,篩選研究了這些提取物的抗癌細(xì)胞增殖及抗內(nèi)皮細(xì)胞增殖的活性。本研究目的是:1)在細(xì)胞水平評價(jià)這些中藥材是否具有抗癌細(xì)胞和抗血管生成活性;2)確定它們的活性成分所在的提取部位。這項(xiàng)研究為我們將來從中草藥中發(fā)現(xiàn)抗癌活性成分并研究開發(fā)以中草藥為源頭的抗癌藥物提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 藥材

本文所用 48種中藥材(TCMs)均購自廣州市同仁堂藥業(yè)五羊店,都有明確的省縣(市)產(chǎn)地記錄。

1.2 細(xì)胞

激活內(nèi)皮細(xì)胞增殖是血管生成的最重要的環(huán)節(jié)[2,3],本文所用的內(nèi)皮細(xì)胞是人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC),HUVEC由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院周國春實(shí)驗(yàn)室從新鮮人臍帶中原代分離、傳代培養(yǎng),藥物篩選所用細(xì)胞為 3～8代 HUVEC;人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞A549來源于ATCC(http://www.atcc.org),由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院裴端卿實(shí)驗(yàn)室保存;人肝癌細(xì)胞 Bel-7402購自武漢大學(xué)細(xì)胞典藏中心,由中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院周國春實(shí)驗(yàn)室保存。

1.3 試劑

石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和乙醇或甲醇等均購自廣東省西隴化工有限公司;DMSO購自 Sigma; MTT購自 AMRESCO;RPM I-1640、DMEM/H IGH GLUCO購自 Hyclone;EG M-2購自 LONZA (cc-3162);小牛血清購自 G IBCO。

陽性藥物:A549細(xì)胞增殖陽性抑制藥物紫杉醇(Taxol)購自福建南方生物技術(shù)股份有限公司;Bel-7402細(xì)胞增殖陽性抑制藥物多柔比星 (阿霉素/ ADM)購自廣東省藥品檢驗(yàn)所;HUVEC細(xì)胞增殖陽性抑制藥物 TNP470為中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院周國春實(shí)驗(yàn)室合成。

1.4 儀器

粉碎機(jī)(溫嶺林大,DFT-200);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (廣州予華,RE-5299);低溫冷卻液循環(huán)泵 (廣州予華, DLSB-5L/25);冷凍干燥機(jī) (廣州正儀,FD-1D-80);超級酶標(biāo)儀 (美國,B IO-TEK);二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);超凈工作臺(Thermo)。

2 方法

2.1 藥材提取方法

將藥材用粉碎機(jī)粉碎后按以下方法提取 (括號內(nèi)為提取方法的縮寫,以下同此縮寫)。

順序提取:稱取 40 g粉碎藥材依次用 8倍體積量(～320 mL)溶劑石油醚(P)、二氯甲烷(D)、乙酸乙酯(E)、甲醇 (M)和水 (W)室溫浸提 3次,24 h/次,室溫減壓回收溶劑或凍干得待測樣品。

水熱提:稱取 40 g粉碎藥材用 8倍體積量 (～320 mL)水(H)100℃提取 3次,提取時(shí)間分別為 3、2和 1 h,60℃減壓蒸去大部分水后凍干得待測樣品。

單獨(dú)提取:稱取 40 g粉碎藥材單獨(dú)用 8倍體積量(～320 mL)乙醇 (N)或二氯甲烷 (d)提取 3次, 24 h/次,減壓回收溶劑得待測樣品。

2.2 活性篩選方法

2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理

A549和Bel-7402細(xì)胞的培養(yǎng)液是含 10%小牛血清的 RPM I-1640,HUVEC細(xì)胞培養(yǎng)液是 EG M-2 (含生長因子),細(xì)胞在 37℃,5%CO2條件下維持培養(yǎng)。

按A549細(xì)胞、Bel-7402細(xì)胞每孔 1500個(gè)細(xì)胞接種于 96孔板,HUVEC細(xì)胞為每孔 1000個(gè)細(xì)胞接種于 96孔板,待細(xì)胞貼壁后加入藥物 (藥物先用DMSO溶解,加藥前用 PBS稀釋),溶劑對照組和加藥組(包括陽性藥物)的細(xì)胞培養(yǎng)液中 DMSO終濃度均為 0.1%,每個(gè)濃度有 3個(gè)復(fù)孔。

2.2.2 MTT檢測

加藥再繼續(xù)培養(yǎng) 96 h后,每孔加入 20μL MTT (5.0 mg/mL),再在 37℃,5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h,然后吸去細(xì)胞培養(yǎng)液,每孔加入 100μL DMSO分析純試劑溶解 MTT被還原的產(chǎn)物-藍(lán)紫色For mazan結(jié)晶,并于超級酶標(biāo)儀 570 nm下讀數(shù)。超級酶標(biāo)儀讀數(shù)是 For mazan的吸光度值 (OD570),其反映活細(xì)胞的還原酶活力與細(xì)胞的活力成正比,因此基于溶劑對照組和加藥組吸光度值可以計(jì)算出陽性藥物(表 1)和各個(gè)提取物的 I C50(表 2)。

3 結(jié)果

3.1 藥物篩選結(jié)果

HUVEC、Bel-7402和 A-549的陽性藥物的活性見表 1。41種中藥材的多種提取物 (至少一種提取物)對 HUVEC、Bel-7402和 A-549細(xì)胞增殖有抑制活性,表 2列出了它們的活性結(jié)果 IC50,為了便于對照,我們還列舉了這些藥材文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]的主要化學(xué)成分類別。

表 1 陽性藥物抑制細(xì)胞增殖的活性結(jié)果 (IC50)Table 1 Activity data(IC50)for positive compounds against corresponding cell proliferation

順序提取的所有提取物對 3種細(xì)胞都沒有抑制活性 (IC50≥50μg/mL)的藥材是:石韋 (Folium Pynosiae)、卷柏(Herba Selaginellae)、馬鞭草(HerbaVerbenae)、急性子(Sem en Im patientis)、側(cè)柏葉(Cacum en Platycladi)、牛膝(Radix Achyranthis B identatae)和赤芍(Radix Paeoniae Rubra)。

表 2 41種中藥材提取物抑制細(xì)胞增殖的活性結(jié)果 (I C50)及文獻(xiàn)報(bào)道的主要化學(xué)成分Table 2 Activity data(IC50)for 41 TCMs’extracts against cell proliferation of HUVEC,Bel-7402 and A549 and these TCMs’major constituents reported in literatures

注:a所有提取物對 3種細(xì)胞都沒有活性的藥材未列在此表中;b除指定外,所有藥材均進(jìn)行了順序提取;c對 3種細(xì)胞都沒有抑制活性的系列提取物未列在此表中;d只進(jìn)行指定溶劑的單獨(dú)提取;“–”表示無活性 (IC50≥50μg/mL)。Notes:aTCMs without activity against all three cells were not included in the table;ball listed TCMswere conducted by sequential extraction unless designated;cthe extractwithout any inhibitory activity to three cellswas not listed in the table;dextracted onlywith designated solvent;“–”means“I C50≥50μg/mL”.

分析上述不同提取方法的提取物的活性結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),活性成分被二氯甲烷 (D或 d)提取的幾率較大,其次是乙酸乙酯 (E)及石油醚 (P);而活性成分被大極性溶劑如甲醇 (M)、乙醇 (N)和水 (W或H)的提取效率相對較低。

3.2 對 HUVEC增殖有明顯活性 (IC50≤10μg/ mL)的中藥材共 22種

按文獻(xiàn)報(bào)道藥材所含的成分分類 (括號內(nèi)為提取方法的縮寫):1)含有醌類結(jié)構(gòu)的藥材為瞿麥(N)、紫草(P、E、D)、茜草 (D、E);2)含有黃酮及木質(zhì)素類結(jié)構(gòu)的藥材為仙鶴草 (P)、小薊 (N)、路路通(P、D)、凌霄花(E)、雞冠花 (D)、槐米 (E、D)、蒲黃(D、P、M)、艾葉 (N)、降香 (E、H、D)、蘇木 (D、H、M、E)、一點(diǎn)血(D)、黃芩(D、E);3)含有酚類結(jié)構(gòu)的藥材為仙鶴草(P)、矮地茶 (D)、小薊(N)、降香 (E、H、D);4)含氮類化合物的藥材為馬齒莧 (W)、馬勃(D)、一點(diǎn)血(D);5)菲、蒽、萘類化合物的藥材為紫草(P、E、D)、白及 (D、E)、茜草 (D、E);6)甾體、萜類化合物的藥材為馬齒莧 (W)、馬勃 (D)、路路通(P、D)、凌霄花(E)、槐米 (E、D)、艾葉 (N)、九里香(D)、雞血藤(d)、紫草(P、E、D)、穿山龍 (E、M、D)、茜草(D、E);7)含有香豆素結(jié)構(gòu)的藥材為矮地茶(D)、九里香(D)。

3.3 對 Bel-7402增殖有明顯活性 (IC50≤10μg/ mL)的中藥材共 6種

按文獻(xiàn)報(bào)道藥材所含的成分分類 (括號內(nèi)為提取方法的縮寫):1)含有醌類結(jié)構(gòu)的藥材為紫草 (P、D)、茜草(D);2)含有黃酮及木質(zhì)素類結(jié)構(gòu)的藥材為蒲黃 (D)、降香(H)、茜草 (D)、黃芩 (D);3)含有酚類結(jié)構(gòu)的藥材為降香 (H);4)菲、蒽、萘類化合物的藥材為紫草 (P、D)、茜草 (D);5)甾體、萜類化合物的藥材為紫草 (P、D)、穿山龍 (E)、茜草 (D);6)含有氮類化合物的藥材為茜草(D)。

3.4 對A-549增殖有明顯活性 (I C50≤10μg/mL)的中藥材共 6種

按文獻(xiàn)報(bào)道藥材所含的成分分類 (括號內(nèi)為提取方法的縮寫):1)含有醌類結(jié)構(gòu)的藥材為紫草(P)、茜草 (D、E);2)含有黃酮及木質(zhì)素類結(jié)構(gòu)的藥材為蒲黃(D)、降香(E、D)、蘇木 (E)、茜草 (D、E); 3)含有酚類結(jié)構(gòu)的藥材為降香 (E、D);4)是菲、蒽、萘類化合物的藥材為紫草 (P)、茜草 (D、E);5)甾體、萜類類化合物的藥材為紫草 (P)、穿山龍 (E、 M)、茜草(D、E)。

4 討論

本次研究共篩選了分屬于多個(gè)科屬的 48種中藥材,除 7種中藥材外其余的 41種中藥材都具有一定的抗血管生成和/或抗癌細(xì)胞活性,其中有些中藥材的同一提取物對 2種或以上細(xì)胞有增殖抑制活性,對 3種細(xì)胞的增殖均有明顯抑制活性 (IC50≤10 μg/mL)的藥材有 5種。另一方面,活性篩選結(jié)果發(fā)現(xiàn)同一藥材不同提取方法得到的提取物活性差異很大,因此有效的提取方法和合理的分配原則可能可以將一些沒有活性的成分排除在外使得有活性的成分能夠得到富集。這些初步研究結(jié)果不僅對從中草藥中尋找抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和抗癌細(xì)胞增殖活性的藥物研究打下基礎(chǔ),而且為將來進(jìn)一步研究各種不同成分之間藥理藥效活性的相互依存、相互促進(jìn)、相互拮抗等關(guān)系提供了基本實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 Hanahan D,Weinberg RA.The hallmarks of cancer.Cell, 2000,100:57-70.

2 Folkman J.Tumor angiogenesis:therapeutic implications.N Engl J M ed,1971,285:1182-1186.

3 Folkman J.Angiogenesis:an organizing principle for drug discovery.Nat Rev D rug D iscov,2007,6:273-286..

4 Newman DJ.Natural products as leads to potential drugs:an old processor the new hope for drug discovery.J M ed Chem, 2008,51:2589-2599.

5 Newman DJ,Cragg G M.Natural products as sources of new drugs over the last 25 years.J Nat Prod,2007,70:461-477.

6 Newman DJ,Cragg G M.Natural products from marine invertebrates and microbes as modulators of antitumor targets.CurrD rug Targets,2006,7:279-304.

7 Edited by Nanjing University of Chinese Medicine(南京中醫(yī)藥大學(xué)編),The Dictionary of Traditional Chinese Medicines(中藥大辭典),Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,2006.

8 Gao XM(高學(xué)敏),Xu Z M(許占民),Li Z W(李鐘文),et al.ChineseMedicines(中藥學(xué)).Beijing:People’sMedical Publishing House,2000.

9 Xiao CH(肖崇厚).Chemistry of Chinese Medicines(中藥化學(xué)).Shanghai:Shanghai Scientific&Technical Publishers,1987.

CHEN Long1,2,L IU Ying-xue2,CHEN Shao-peng2,LU Xin2,CHENG Hao2,SONG Shao-jiang1,ZHOU Guo-chun2＊

1School of Traditional Chinese Materia M edica,Shenyang Pha rmaceuticalUniversity, Shenyang 110016,China;2Guangzhou Institute of B iom edicine and Health,Guangzhou 510663,China

Antiproliferative Inhibition of Endothelial Cell and Cancer Cells by D ifferent Extracts of 48 Traditional Chinese M edicines

Sequential extraction or individual extraction of 48 Traditional Chinese Medicines(TCMs)by petroleum ether,dichloromethane,ethyl acetate,methanol,ethanol,water or boilingwaterwas conducted and antiproliferative activity of these extracts againstHUVEC,Bel-7402 and A549 proliferation was assayed.The results in this report showed that 41 of 48 studied TCMs expressed antiproliferative activity to HUVEC or/and cancer cells,in which 22,6 and 6 studied TCMs exhibited good inhibition(IC50≤10μg/mL)to the proliferation of HUVEC,Bel-7402 and A549,respectively,and 5 studied TCMs behaved good inhibitory activity(IC50≤10μg/mL)to all three cells’proliferation.

Traditional ChineseMedicine(TCM);antiproliferative activity;HUVEC;Bel-7402;A-549

R282.7/05;Q946.91

A

1001-6880(2010)04-0692-05

2009-06-22 接受日期:2009-09-15

中國科學(xué)院人口健康與醫(yī)藥創(chuàng)新基地重要方向項(xiàng)目(KSCX-2-Y W-R-22);廣東省中醫(yī)藥局項(xiàng)目(2007202)

＊通訊作者 Tel:86-20-32290487;E-mail:zhou guochun@gibh.ac.cn