不同光強和光質(zhì)對白樺幼樹體內(nèi)三萜積累的影響

李新宇,尹 靜,詹亞光＊,任春林,邱 偉,陳秀福,景麗鴻

1東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,哈爾濱 150040;2東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場,哈爾濱 150040

不同光強和光質(zhì)對白樺幼樹體內(nèi)三萜積累的影響

李新宇1,尹 靜1,詹亞光1＊,任春林1,邱 偉1,陳秀福1,景麗鴻2

1東北林業(yè)大學(xué)生命學(xué)院,哈爾濱 150040;2東北林業(yè)大學(xué)帽兒山實驗林場,哈爾濱 150040

來源于白樺樹皮中的五環(huán)三萜類次生代謝產(chǎn)物白樺酯醇和齊墩果酸,具有廣泛的藥理學(xué)活性,是具開發(fā)潛力的抗癌和抗艾滋病毒類天然物質(zhì)。本研究以白樺幼樹為研究試材,通過不同光質(zhì)和光強處理,檢測白樺樹各部位白樺酯醇和齊墩果酸含量變化。結(jié)果表明,與對照 (白光)相比,紅、黃、藍(lán)、綠 4種光質(zhì)處理均降低白樺莖外皮中這兩種三萜物質(zhì)的積累;綠光處理下可顯著提高葉片中齊墩果酸含量,而藍(lán)光處理下可顯著提高葉片中白樺酯醇含量,兩種物質(zhì)分別為對照的 13.28倍和 1.959倍。生長季節(jié)內(nèi),莖皮中齊墩果酸和白樺酯醇含量以八月份最高,極顯著高于其它月份,且以遮光處理 (50%自然光)的效果較佳,齊墩果酸和白樺酯醇含量比正常光處理分別提高 30.50%和 45.09%。白樺植株中白樺酯醇和齊墩果酸含量的變化顯著受到季節(jié)的調(diào)控。該研究為白樺樹中三萜物質(zhì)高效積累的栽培技術(shù)建立和代謝調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

白樺;光;白樺酯醇;齊墩果酸

白樺酯醇和齊墩果酸同為五環(huán)三萜類次生代謝產(chǎn)物,具有多種的藥理學(xué)活性,包括抗腫瘤[1-3]、抗艾滋病[4]、抗真菌[5]、抗病毒[6]、降脂、利膽和保肝等作用[7]。白樺酯醇和齊墩果酸均是植物天然產(chǎn)物,療效高而毒性低,具有廣闊的醫(yī)用前景。

光是植物生命活動中重要的環(huán)境因子之一,它不僅是植物生長發(fā)育的能量來源,而且作為信號因子調(diào)控植物的生長發(fā)育,初生代謝和次生代謝過程。植物的次生代謝產(chǎn)物是植物對生長環(huán)境長期適應(yīng)的結(jié)果,它們的代謝過程復(fù)雜而且種類繁多。很多研究報道了光強和光質(zhì)對生物堿、黃酮類、萜類內(nèi)酯、揮發(fā)性成分、糖苷等次生代謝物質(zhì)影響[8-12]。國內(nèi)外關(guān)于白樺三萜類物質(zhì)的報道主要集中在白樺三萜的化學(xué)合成[13]、提取方法及藥理學(xué)試驗方面[3,4],本實驗室對不同種源地和不同樹齡及部位中白樺酯醇含量進行了比較和檢測[14]。而在生長季節(jié)內(nèi)關(guān)于白樺幼樹次生代謝產(chǎn)物合成與光的關(guān)系尚不明確。本試驗以一年半生白樺幼樹為材料,研究不同光質(zhì)和照度光處理后白樺各部位中次生代謝產(chǎn)物白樺酯醇和齊墩果酸含量的變化,以期為白樺樹中三萜物質(zhì)高效積累的栽培技術(shù)和代謝調(diào)控研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

2007年在東北林業(yè)大學(xué)帽兒山試驗基地溫室大棚中進行白樺育苗,2008年 5月將白樺幼苗移栽于直徑 25 cm,高 35 cm塑料缽中,土重 20 kg。盆栽用土為苗圃土∶草炭∶砂 (2∶1∶1,V/V/V)比例,細(xì)篩后反復(fù)混勻、保證每盆土壤均勻一致。戶外進行常規(guī)管理,等量澆水。

2 方法

2.1 光照處理

1)光質(zhì)處理:試驗于 6月初在溫室內(nèi)進行,分別采用紅光、藍(lán)光、綠光、黃光濾光膜進行處理,設(shè)透明塑料膜處理為對照,不同光質(zhì)處理一個月后收獲植株,每種處理 3～5株,分別取莖皮、葉片及根皮,烘干待 HPLC分析;2)光強處理:試驗于 6月初在戶外進行,采取黑色遮光網(wǎng)進行遮光處理,透光率為正常光照強度 50%±5%,以正常的戶外光照為對照處理,干旱時等量補水。處理后每隔 30天取樣一次,取樣重復(fù) 3～5株,分別測量單株株高和莖粗,稱取根、莖、葉鮮重,烘干待 HPLC分析。

2.2 高效液相色譜(HPLC)檢測三萜含量

齊墩果酸和白樺酯醇提取:采用改進的超聲波醇法[15]。

檢測條件:用Water公司 600-717-2487色譜系統(tǒng),色譜柱 H iQ sil C18V 4.6 mm×250 mm;流動相為乙腈∶水 =4∶1;柱溫 25℃;靈敏度 16AUFS;流速1.0 mL/min;檢測波長 210 nm,進樣 10μL。白樺酯醇含量計算依據(jù)線性回歸方程:y=204940x+ 14282,r2=0.99875齊墩果酸含量計算依據(jù)線性回歸方程:y=1028152.5x+35616,r2=0.99943

式中,y為液相色譜檢測峰面積,x為樣品濃度(mg/mL)。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同光質(zhì)處理對白樺植株中三萜含量變化的影響

由圖 1(A,B)表明,與對照相比 (白光),4種光質(zhì)(紅、黃、藍(lán)、綠)處理均降低了莖外皮中齊墩果酸和白樺酯醇的積累。除紅光處理顯著促進根皮中齊墩果酸的積累 (較對照增長 49.12%)外,不同光質(zhì)處理均不利于根皮中齊墩果酸和白樺酯醇含量積累。4種光質(zhì)處理均能促進葉片中這兩種三萜物質(zhì)的積累,其中綠光處理對齊墩果酸積累和藍(lán)光處理對白樺酯醇處理效果為最佳,兩個處理分別是對照含量的 13.28倍和 1.959倍。

圖 1 白樺植株不同部位齊墩果酸和白樺酯醇含量變化Fig.1 Contents change of oleanolic acid and betulin in different parts of the birch plant

3.2 光強處理下白樺植株生長及三萜含量變化

表 1表明,在生長季節(jié),八月份,莖皮中,無論是齊墩果酸還是白樺酯醇含量積累均達(dá)到最高值,極顯著高于其它月份,而且以遮光處理的效果較佳,齊墩果酸和白樺酯醇含量比正常光處理分別提高30.50%和 45.09%。說明適當(dāng)?shù)恼诠馓幚碛欣诎讟鍢淝o皮中這兩種三萜物質(zhì)的積累,但其含量明顯受季節(jié)調(diào)控。另外,葉片和根皮中次生代謝產(chǎn)物積累也以 8月份較高,葉片中齊墩果酸、白樺酯醇及根皮中白樺酯醇含量都以遮光處理較高,其他月份含量都極低,甚至不能被檢測到,所以數(shù)據(jù)未列出。

圖 2 生長季節(jié)內(nèi)遮陰和全光照處理下白樺植株各部位生長變化Fig.2 Growth change of diffrent part of the birch plant under shade light and the whole light during growing season

由圖 2(A,B)可見,生長季節(jié)內(nèi) 6月～10月,株高和莖粗均逐漸增長,以遮光處理有利于株高生長,而正常光照下地徑略高。6月和 7月植株根、莖、葉的鮮重表現(xiàn)生長迅速,以正常光照處理表現(xiàn)鮮重增長較高,遮光處理對生長略有抑制。8月以后,開始逐漸有少量落葉,致使 9月份和 10月份葉片鮮重未做統(tǒng)計。

4 討論

成年白樺樹外皮中含有較豐富的白樺酯醇三萜,因樹種、年齡、季節(jié)和生長條件影響,含量一般在10%～40%之間 (干重),而成年樹中齊墩果酸也曾被報道過,但關(guān)于白樺幼樹中齊墩果酸積累與分布很少有研究。本實驗室在之前的研究表明,不同樹齡的白樺樹的葉、莖外皮和根皮中都能檢測出齊墩果酸和白樺酯醇,但主要集中在莖外皮中,葉片和根皮中含量極低[14],本研究表明,莖皮和根皮中白樺酯醇和齊墩果酸積累高峰出現(xiàn)在 8月,兩者在莖皮中最高含量可分別約達(dá)植株干重 8.10%和 2.64%,葉片僅在 8月和 9月可以檢測少量積累,其他月份含量極低,甚至檢測不到,說明因季節(jié)變異次生代謝產(chǎn)物含量變化顯著。

綠色植物通過光合作用制造有機物,經(jīng)過植物體內(nèi)的運輸和轉(zhuǎn)化產(chǎn)生各級代謝產(chǎn)物,因此,光照對植物有效成分的形成和積累是必須的。以往研究表明,對于某些陽生藥用植物,光強的增加能夠提高其次生代謝物質(zhì)的含量,如生于陽坡的金銀花中綠原酸的含量高于陰坡[16];絞股藍(lán)在強光條件下其黃酮類化合物含量較高。而對于陰生植物,則須適當(dāng)遮蔭以減少光照強度等,研究發(fā)現(xiàn)在 20%的蔭棚透光率時人參皂甙含量最高,為干重的 4.5%[17]。遮蔭處理可對銀杏幼樹葉片中藥用成分槲皮素的含量有顯著的促進作用[8];喜樹幼苗葉片的喜樹堿含量隨著遮蔭程度的增加而增加,但嚴(yán)重遮蔭的 (光強為全光照的 20%)在處理后期 (75d)喜樹堿含量降低[11]。通過紅、黃、藍(lán)三種濾光膜處理可促進喜樹堿在幼苗葉片中的積累,提高了葉片喜樹堿產(chǎn)量。其中在處理后第 10 d至第 30 d,幼苗葉片喜樹堿含量均顯著高于白光處理,以藍(lán)膜下幼苗的喜樹堿含量最高[10]。

本研究發(fā)現(xiàn),紅、黃、藍(lán)、綠四種光質(zhì)處理促進了白樺樹葉中三萜物質(zhì)含量提高,但卻顯著降低了莖外皮中白樺酯醇和齊墩果酸的積累,所以在進行光質(zhì)調(diào)控時應(yīng)根據(jù)人們所需部位進行選擇光,如需要葉片進行制備茶葉,可以進行光質(zhì)處理,提高三萜物質(zhì)含量。然而,如果目的是進行莖皮部位的三萜物質(zhì)合成,則不適宜光質(zhì)處理。另外,研究中發(fā)現(xiàn)各種光質(zhì)處理后出現(xiàn)葉片萎蔫現(xiàn)象,且嚴(yán)重抑制了植株的生長,一個月內(nèi)生物量未見增長,說明光質(zhì)處理后嚴(yán)重制約了葉片的光合作用,導(dǎo)致其正常的光合作用產(chǎn)物嚴(yán)重不足,不能維持其基本的生理代謝所致,影響植株生長和次生代謝產(chǎn)物積累,這也是本實驗中光質(zhì)處理僅持續(xù)一個月的原因。適當(dāng)?shù)恼诠馓幚?透光率 50%左右)同全光照相比,雖抑制了植株生長 (圖 2),但對植株莖皮中次生代謝產(chǎn)物積累有利,這一結(jié)果說明次生代謝產(chǎn)物積累與植物生長所需的最適宜的環(huán)境條件存在一定的矛盾。這一點與以往研究結(jié)果相似,即不利于初生代謝的脅迫生態(tài)環(huán)境有利于藥用植物次生代謝產(chǎn)物的積累[18]。因此,需要根據(jù)每種植物次生代謝的生態(tài)適應(yīng)性特點,選擇具有一定環(huán)境壓力的次適宜生態(tài)環(huán)境,以兼顧一些藥用植物栽培中生長和次生產(chǎn)物積累的平衡。

1 Pisha EH,Chai IL,et al.Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis.NatM ed,1995,1:1046-1051.

2 LiW(李薇),et al.Antitumor activity and immunoregulatory effect of triterpenes isolated fromBetula platyphylla.Chin J Immunology(中醫(yī)中藥與免疫),2000,9:485-487.

3 Zhukova NA,SemenovDE,Sorokina IV,et al.Effect of betulonic Acid and its derivative[3-Oxo-20(29)-Lupene-28-Oyl]-3-Aminopropionic acid on liver structure in mice with RLS lymphoma.B iol Phar m Bull,2005,9:348-351.

4 Li F,Goila-Gaur R,Salzwedel K,et al.PA-457:A potent H IV inhibitor that disrupts core condensation by targeting a late step in Gag processing.PNAS,2003,100:13555-13560.

5 Kovalenko LP,Balakshin VV,Presnova GA,et al. Immunotoxicity and allergenic properties of betulin-containing birch bark dry extract.Phar m Chem J,2007,41:18-20.

6 Liu ZQ(劉志芹),Zhang QY(張慶云),et al.Study on the anti-fungal activity of the bark and the leaves ofBetulaplatyphylla.Tianjin Phar m(天津藥學(xué)),2004,16(3):3-4.

7 LiD(李丹),Zhou JP(周金培),Wu XM(吳曉明).Recent advances of betulinic acid and its derivatives.Progress in Phar m Sci(藥學(xué)進展),2004,28(3):120-125.

8 Leng PS(冷平生),Su SC(蘇淑釵),Wang TH(王天華). Effects of light intensity and light quality on photosynthesis, flavonol glycoside and terpene lactone contents ofGinkgo bilobaL.seedlings.J Plant Resources Environ(植物資源與環(huán)境學(xué)報),2002,11:1-4.

9 Yan(閻秀峰),Wang Y(王洋),Shang XH(尚辛亥). Effects of field light intensity and quality on biomass and salidroside content in roots ofRhodiola sachalinensis.Acta Ecologica Sinica(生態(tài)學(xué)報),2004,24:674-679.

10 Dai SJ(戴紹軍),Wang Y(王洋),Yan XF(閻秀峰),et al.Effects of color films on growth and camptothecin content in the leaves ofCam ptotheca acum inataseedlings.Acta Ecologica Sinica(生態(tài)學(xué)報),2004,24:869-875.

11 Wang Y(王洋),Dai SJ(戴紹軍),et al.Effects of light intensity on secondary metabolite camptothecin production in leaves ofCamptotheca acum inataseedlings.Acta Ecologica Sinica(生態(tài)學(xué)報),2004,24(6):1118-1122.

12 Zhou YT(周憶堂).Studies on the effectof different light intensity on the photosynthesis and secondary metabolit of catharanthus roseus.Chongqing:Southwest University(西南大學(xué)),MasterD.2008.

13 Zhang T,Li L,Song LR,et al.Synthetic approach to analogues of betulinic acid.Tetrahedron,2006,62:9321-9334.

14 Yin J(尹靜),Zhan YG(詹亞光),Li XY(李新宇).Changes of distribution and content of betulin and oleanolic acid in different apparatus and in induced callus of culture seedling from birch(Betula platyphylla suk.).Plant Phys Commun(植物生理學(xué)通訊),2009,45:610-614.

15 Zhang Z(張澤),Sun H(孫宏).Determination of betulin content from bark ofBetula platyphyllasuk.by HPLC.Chemistry&Industry of Forest Products(林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè) ), 2004,24(1):61-63.

16 LiQ(李強),Ren Q(任茜),Zhang YL(張永良).Effects of ecological environment,collecting stages and storage time on chlorogenic acid content ofLonicera ferdinandiiFranch.China J Chin M atM ed(中國中藥雜志),1994,18:594-595.

17 Zhang ZA(張治安),Xu KZ(徐克章),Ren YY(任躍英). Effect of light intensity on content of soluble sugar,starch and ginseng saponin in ginseng plant.J Jilin Agric Univ(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報),1994,16(3):15-17.

18 Lu SP(魯守平),SuiXX(隋新霞),SunQ(孫群),et al.Biological functions of secondary metabolism of medicinal plants and influencesof ecological environment.Nat Prod Res Dev(天然產(chǎn)物研究與開發(fā)),2006,8:1027-1032.

Effect of D ifferent Intensity and Quality of L ight on Accumulation of Triterpenoid in Birch(Betula platyphyllasuk.)Seedlings

L IXin-yu1,YIN Jing1,ZHAN Ya-guang1＊,REN Chun-lin1,Q IU Wei1,CHEN Xiu-fu1,J ING Li-hong2

1College of Life Sciences,2M aoershan Experim ental Forestry Center, Northeast Forestry University,Harbin 150040,China

Betulin and oleanolic acid in bark of the white birh trees as the secondarymetabolites of pentacyclic triterpenoid,have extensively phar macological activities,which are the natural substancesworthy of being empoldered in using for anti-cancer and anti-H IV. In this study,betulin and oleanolic acid content in different parts of birch seedlings which were treated by different intensity and quality of light,were analyzed.The results showed thatwith the comparion of control(white light),the accumulation of the two triterpenoids in their stem skin decreased under four kinds treatment of light quality include the red,yellow,blue,green.Oleanolic acid content in leaf of white birch treated by the green light and betulin content in leaf treated by blue light were significantly increased,which were 13.28 times and 1.959 t ime higher than thatof control,respectively.In the growing season(from June toOctober),the highest contents of oleanolic acid and betulin in the stem bark was in August,which were higher than other months.The best shading treatmentwas 50%of natural light.Under the condition,oleanolic acid and betulin content in the stem bark were increased to 45.09%and 30.50%higher than nor mal light,respectively.The contents of oleanolic acid and betulin in plants changed with the seasons.The research laid bases for seting up the cultivation technology of high efficient accumulation and metabolic regulation study of the triterpenoid substances ofwihte birch.

Birch;light;betulin;oleanolic acid

Q946.91;R284.1

A

1001-6880(2010)03-0475-04

2009-06-25 接受日期:2009-09-21

黑龍江省自然基金重點項目(ZD200918);中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項基金項目(DL09BA14);中國博士后基金(20080430873)

＊通訊作者 Tel:86-451-82191752;E-mail:yaguangzhan@126.com