殼聚糖中胺基對其抑菌性能的影響及與DNA的作用

李小芳,馮小強,伏國慶,楊 聲＊,蘇中興

1天水師范學院生命科學與化學學院;2天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗科,天水 741001;3蘭州大學化學化工學院,蘭州 730000

殼聚糖中胺基對其抑菌性能的影響及與DNA的作用

李小芳1,馮小強1,伏國慶2,楊 聲1＊,蘇中興3

1天水師范學院生命科學與化學學院;2天水市中醫(yī)醫(yī)院化驗科,天水 741001;3蘭州大學化學化工學院,蘭州 730000

采用抑菌圈法研究了殼聚糖對大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌 (St.aureus)的抑菌活性。利用殼聚糖的席夫堿反應(yīng),對殼聚糖的胺基進行保護后,研究了殼聚糖中胺基對其抑菌性能的影響。同時,運用紫外吸收光譜和電化學的方法,研究了殼聚糖與 DNA的相互作用,提出了殼聚糖對E.coli和St.aureus的抑菌機理。研究結(jié)果表明,殼聚糖對E.coli和St.aureus具有很好的抑制作用,且抑菌活性與其胺基有關(guān);殼聚糖能與細胞內(nèi)帶負電的核酸結(jié)合,使細胞正常DNA復制生理功能受到影響,抑制細菌的繁殖,從而達到抑菌的目的。

殼聚糖;抑菌活性;希夫堿;胺基;DNA

殼聚糖(Chitosan,簡稱 CTS)是甲殼素脫乙酰的產(chǎn)物,來源豐富、無毒,是可吸收降解的直鏈狀高分子化合物。殼聚糖及其衍生物具有廣譜的抗菌性能,可抑制多種細菌和真菌的生長[1-5]。但是,就其確切的抑菌機理目前尚不清楚。Young等認為殼聚糖可吸附于細菌表面,與細菌細胞膜作用而改變其通透性[6];Helander等提出,殼聚糖對革蘭氏陰性菌的抑菌作用是由于細胞外膜被破壞,最終造成菌體死亡[7];Hadwiger提出以細菌分子中DNA為作用靶向的抗菌機理[8];Tokura等認為殼聚糖吸附細菌后,殼聚糖分子包埋了整個細胞,抑制了細菌的呼吸和營養(yǎng)物質(zhì)的進入而導致細菌死亡[9];Papineu等研究認為殼聚糖的抑菌作用可能是由于它導致了細胞內(nèi)物質(zhì)的泄漏而引起的[10]。普遍認為殼聚糖的抑菌機理存在以下幾種可能:(1)殼聚糖干擾菌體細胞膜的功能,從而達到抑菌的效果;(2)殼聚糖直接與菌體的DNA和mRNA作用;(3)殼聚糖激活幾丁質(zhì)酶,達到抑菌的目的;(4)殼聚糖中的胺基在起抑菌作用;(5)殼聚糖與細胞質(zhì)發(fā)生作用。其中殼聚糖對細菌 DNA的作用是基于其抗菌機理研究的推論。有一種推論認為帶有正電的低分子量殼聚糖進入到細菌細胞內(nèi)部,與帶有負電的DNA作用,干擾其復制,或阻礙mRNA的合成。劉曉非等用激光共焦顯微鏡對異硫氰酸熒光素 (FITC)標記的低分子量殼聚糖 (Mw≤8000)與大腸桿菌作用的觀察,發(fā)現(xiàn)具有抗菌性的殼聚糖齊聚物進入到了細菌細胞的內(nèi)部[11]。

一般認為殼聚糖的抑菌性能主要由-NH2引起的。利用殼聚糖上的胺基與醛 (或酮)發(fā)生反應(yīng)生成相應(yīng)的醛 (或酮)亞胺化衍生物[12,13],對胺基進行了保護后,研究了殼聚糖中的胺基對殼聚糖抑菌性能的影響。運用紫外吸收光譜和電化學分析的方法,研究了殼聚糖與 DNA的相互作用,初步提出了殼聚糖對E.coli和St.aureus的抑菌機理。該研究為殼聚糖的臨床應(yīng)用提供更加充分的實驗依據(jù),并擴大了殼聚糖在醫(yī)藥和食品工業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

大腸桿菌 (E.coli,ATCC 35218),金黃色葡萄球菌 (St.aureus,ATCC 26113)。相對分子量 50,000的殼聚糖 (浙江玉環(huán)殼聚糖有限公司,DD.98%), DNA(美國 Sigma公司),其純度通過比較 260與280 nm處吸光度來確定 (A260/A280=1.87)。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基[14]。0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液由NaH2PO4-Na2HPO4配制;試劑均為分析純,實驗用水均為二次蒸餾水,電化學實驗均在室溫條件下通氮氣 10 min后進行。

UV-9200型紫外可見分光光度計 (北京瑞利分析儀器公司);Spectrum One FT-I R(Perkin Elmer); TG-TDA(Pyris Diamond TG/DTA);EC-12B型多功能微機電化學分析儀 (江蘇江分電分析儀器公司),三電極系統(tǒng) (工作電極:金電極,輔助電極:鉑絲電極,參比電極:Ag-AgCl電極)。

1.2 抑菌圈法測定殼聚糖的抑菌活性[15]

抑菌圈法是將含有定量抗生素的濾紙片貼在已接種了測試菌的瓊脂表面上,紙片中的藥物在瓊脂中擴散,隨著擴散距離的增加抗生素的濃度呈對數(shù)減少,在藥物濃度到達的范圍內(nèi)對此藥敏感的細菌不能生長而形成透明的抑菌圈,不同細菌形成的抑菌圈各不相同,抑菌圈的大小反映了測試菌對該藥的敏感程度。如果抑菌劑能殺死或抑制皿中供試菌的生長,則在濾紙片的周圍會出現(xiàn)一個無菌生長的透明圈,即抑菌圈。以抑菌圈的直徑作為評定指標,抑菌圈直徑越大,說明該抑菌劑對此種供試菌的抑制效果越好,反之則抑制效果越差將受試菌種接種于固體瓊脂培養(yǎng)基,37℃活化E.coli24 h,St.aureus活化48 h。將活化后的受試菌種用接種環(huán)挑取菌苔于生理鹽水中,制成 O.D630(E.coli)=0.745;O.D 630(St.aureus)=0.624的菌懸液備用。取直徑 6 mm已滅菌的圓濾紙片放入濃度分別為 5 mg/mL、2.5 mg/mL、1.25 mg/mL的殼聚糖溶液(溶于 1.0% HAc)中浸泡。將 0.1 mL菌懸液涂布在培養(yǎng)基平板上,用無菌鑷子取浸泡過的圓濾紙片貼于培養(yǎng)皿中,每皿貼 5片。以 1.0%的 HAc溶液作為空白對照。37℃恒溫培養(yǎng) 48 h,測定圓濾紙片的抑菌圈直徑。

1.3 殼聚糖席夫堿的制備

一定量殼聚糖溶于 20 mL 3.0%HAc攪拌溶脹30 min,加 20 mL無水乙醇稀釋,轉(zhuǎn)入 100 mL圓底燒瓶中,將用 10 mL乙醇分別稀釋的醛 (甲醛、苯甲醛、呋喃甲醛、正丁醛)滴入(η-NH2:η-CHO=1:6),水浴加熱控制溫度 (80℃),回流 5 h。反應(yīng)快結(jié)束時,調(diào) pH到 9～10,抽濾,沉淀用 20 mL無水乙醇和乙醚反復洗滌除過量的醛,烘干后繼續(xù)在索氏萃取器中用 95%乙醇回流 8 h,恒溫干燥分別得到的殼聚糖席夫堿衍生物。

圖 1 希夫堿反應(yīng)方程式Fig.1 The synthesis of Schiff’s base

1.4 殼聚糖席夫堿的表征

1.4.1 紅外吸收光譜測定

采用 KBr壓片法,Spectrum One傅立葉紅外光譜儀 (Perkin E lmere)測量殼聚糖及席夫堿的紅外吸收光譜,測量波長數(shù)為 400～4000 cm-1。

1.4.2熱重-差熱(TG-DTA)分析

采用 Perkin Elmere TG-DTA分析儀 (Pyris Diamond Analyzer),以α-Al2O3為參比,升溫速率 10℃/min,對殼聚糖及席夫堿熱力學分析。

1.5 席夫堿抑菌活性分析

稱取殼聚糖及其希夫堿各 50 mg研磨成粉末,溶于 10 mL 1.0%的 HAc溶液中,配成濃度為 5 mg/ mL的溶液待用。含有15 mL液體培養(yǎng)基和4 mL殼聚糖或席夫堿的試管滅菌后,分別加入 1 mL的E. coli(OD600nm=0.473)或St.aureus(OD600nm= 0.435),使殼聚糖及席夫堿最終濃度為 1 mg/mL;用4 mL 1.0%的 HAc溶液作為空白對照。37℃搖床培養(yǎng),分光光度計下測定不同時間內(nèi)O.D610 nm。

1.6 殼聚糖與DNA相互作用紫外吸收光譜

在 1 cm×1 cm石英比色管中加入一定量的Tris-HCl緩沖液、2μL的DNA溶液和 80μL 1%已在 121℃滅菌了 15 min的殼聚糖溶液,用二次蒸餾水稀釋至刻度,以不含DNA的 Tris-HCl緩沖液為試劑空白,于 200～600 nm波長范圍內(nèi)測定DNA與殼聚糖相互作用后的紫外吸收光譜。

1.7 殼聚糖與DNA相互作用的電化學研究

金電極分別用金相砂紙和在麂皮上用 0.5μm和 0.3μm的α-Al2O3研磨液研磨,再用二次蒸餾水、乙醇、丙酮超聲清洗各 5 min,然后浸入新配制的Piranha(VH2SO4∶VH2O2(30%)=7∶3)溶液中 10 min,用二次蒸餾水和乙醇超聲清洗干凈,氮氣吹干即可。以 0.1 mol/L的空白NaH2PO4-Na2HPO4緩沖液(pH=6.5)為支持電解質(zhì)。先將三電極體系放入空白緩沖液中,在-0.2～1.5 V電位范圍內(nèi)循環(huán)伏安掃描至電流穩(wěn)定為止。處理好的金電極其表面干燥后,滴加 20μL 1.0 mg/mL的 DNA溶液,置于冰箱中干燥 6 h以上。采用傳統(tǒng)的三電極體系,以修飾電極為工作電極,鉑片電極為對電極,Ag-AgCl電極為參比電極,掃描范圍為-0.2～1.5 V(所有實驗均在室溫下進行)。

2 結(jié)果與討論

2.1 殼聚糖對E.coli和St.aureus的抑菌活性

不同濃度殼聚糖對E.coli和St.aureus對應(yīng)的抑菌圈直徑如圖 2,3所示。可以看出,殼聚糖作用E.coli和St.aureus后,均具有明顯的抑菌圈,且隨著殼聚糖濃度的增加,與對照組相比抑菌圈的直徑逐漸增加,說明殼聚糖對E.coli和St.aureus的生長有較好的抑制作用。

2.2 殼聚糖席夫堿衍生物的表征

2.2.1 紅外光譜

圖 4是殼聚糖、殼聚糖-Ⅰ、殼聚糖-Ⅱ、殼聚糖-Ⅲ、殼聚糖-Ⅳ的 FT-IR圖。其中,3441.0 cm-1處是殼聚糖形成氫鍵締合的-OH伸縮振動吸收峰與-NH2的伸縮振動吸收峰重疊而增寬的多重吸收峰, 1599.4 cm-1處是氨基的 N-H特征吸收峰,1651 cm-1處是酰胺吸收峰。殼聚糖席夫堿在 1599.4 cm-1的N-H特征吸收峰消失,這說明-NH2已經(jīng)得到了保護;1638 cm-1附近的吸收峰歸屬 C=N伸縮振動,證明-NH2和-CHO基團發(fā)生了反應(yīng)。

圖 4 殼聚糖、殼聚糖-Ⅰ、殼聚糖-Ⅱ、殼聚糖-Ⅲ和殼聚糖-Ⅳ的紅外光譜Fig.4 I R spectra of chitosan and Schiff’s base

2.2.2 熱重分析

殼聚糖和其席夫堿的 TG如表 2所示。殼聚糖的降解分為三個階段[16]:第一個階段在 80℃開始,失重 10%,主要是失去水分子;第二個階段失重在250℃開始,到 500℃失重達最大,失重 55%;最終分解溫度為 688℃。四種殼聚糖席夫堿衍生物主鏈斷裂的溫度明顯低于殼聚糖主鏈斷裂的溫度,這表明殼聚糖的席夫堿衍生物與殼聚糖相比不穩(wěn)定,它們的不穩(wěn)定性是由于缺少自由的氨基,在制備衍生物時氨基被醛取代,殼聚糖因其有自由的氨基而更穩(wěn)定[17]。

表 1 殼聚糖和席夫堿的 TG數(shù)據(jù)Table 1 Thermograv imetry analysis of chitosan and schiff’s bases

2.3 殼聚糖及席夫堿對E.coli和St.aureus抑菌活性

圖 5是殼聚糖及席夫堿衍生物作用E.coli和St.aureus后不同時間內(nèi) O.D610nm的變化。可以看出殼聚糖席夫堿的 O.D610nm均高于殼聚糖,和對照組的O.D610nm相差不大,說明改性的殼聚糖抑菌活性大大降低。并且發(fā)現(xiàn)隨著時間的延長,苯甲醛與殼聚糖的席夫堿對E.coli有微弱的抑制作用,這可能是結(jié)構(gòu)中含有苯環(huán)的緣故。席夫堿改性后的殼聚糖幾乎失去了抑菌的功能,同時也說明殼聚糖對E.coli和St.aureus的抑制作用主要與-NH2的質(zhì)子化有關(guān)。

圖 5 殼聚糖及希夫堿作用E.coli(a)和St.aureus(b)后的 O.D610nmFig.5 O.D610nmof different Chitosan Schiff bases toE.coliandSt.aureus

2.4 紫外光譜研究殼聚糖與DNA相互作用

由于核酸分子本身有光吸收活性,許多外來分子與核酸結(jié)合后,對核酸或外來分子的吸收都有影響。紫外-可見吸收光譜法是研究外來分子與核酸相互作用機理的最常用、最方便的方法。含有芳香性和磷酸生色基團雙螺旋結(jié)構(gòu)的DNA分子,其UV-vis吸收光譜在 260 nm附件有一強的吸收峰,某些小分子亦有吸收譜帶,可根據(jù)相互作用前后DNA或其他分子的吸收譜帶的變化對二者相互作用模式進行判斷。增色、減色效應(yīng)是DNA特有的與其雙螺旋結(jié)構(gòu)密切相關(guān)的光譜性質(zhì)。對 DNA的吸收光譜來說,如果導致分子的軸向變化即其構(gòu)象變化,則產(chǎn)生減色效應(yīng)及紅移現(xiàn)象,且作用越強減色效應(yīng)越明顯;如果導致 DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的破壞,則產(chǎn)生增色效應(yīng)[18]。對于外來分子的特征吸收譜帶,若該分子與DNA發(fā)生嵌插作用,則該分子的吸收光譜發(fā)生減色效應(yīng)和紅移現(xiàn)象,且作用越強減色效應(yīng)越明顯;若該分子與DNA發(fā)生靜電作用,紫外吸收光譜峰將出現(xiàn)較小的紅移,且減色效應(yīng)不明顯[19]。

圖 6為殼聚糖加入后 DNA的紫外吸收光譜。殼聚糖在 260 nm附近沒有紫外吸收,DNA在 260 nm出現(xiàn)吸收峰,且隨著加入殼聚糖濃度的增加, DNA吸收光譜產(chǎn)生了明顯的增色效應(yīng)和較小的紅移。這些結(jié)果表明殼聚糖與 DNA之間可能由于靜電作用,發(fā)生相互作用而形成了新的復合物,導致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞。

2.5 電化學分析

殼聚糖與DNA作用的循環(huán)伏安曲線如圖 7所示。曲線 a,b,c分別表示裸金電極、DNA修飾金電極以及殼聚糖-修飾金電極在緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖。裸金電極曲線是典型的可逆的氧化還原過程,峰電流相對較大,0.55 V附近的還原峰是對應(yīng)的金氧化物的還原。DNA修飾金電極在 0.7 V附近產(chǎn)生了一個新峰。然而,在DNA修飾金電極上加入殼聚糖后,循環(huán)伏安曲線發(fā)生了明顯的變化,氧化還原峰電流急劇減小,而且沒有新的氧化還原峰出現(xiàn),這表明殼聚糖與 DNA分子之間發(fā)生了鍵合作用,形成的非電活性化合物不能在電極表面發(fā)生氧化還原反應(yīng)。溶液中自由殼聚糖分子的濃度減少,單位時間遷移到電極表面的殼聚糖分子數(shù)下降,導致峰電流減少。

圖 6 殼聚糖溶液的紫外吸收光譜Fig.6 Change ofUV spectra of the complex in the absence and presence of different concentrations ofDNA

圖 7 殼聚糖與DNA作用前后在緩沖溶液中的循環(huán)伏安圖Fig.7 Cyclic voltammetry ofDNA and after incubation with chitosan in 0.1 mol/LNaH2PO4-Na2HPO4(pH 6.5)

3 結(jié)論

3.1 殼聚糖對E.coli和St.aureus有良好的抑制作用,殼聚糖的抑菌活性與其-NH2有關(guān)。

3.2 殼聚糖可能有一部分進入細菌細胞內(nèi)部,與DNA之間由于靜電作用而形成了新的復合物,導致DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)破壞,進而抑制細菌的繁殖。DNA與殼聚糖的可能作用模型如圖 8所示。

圖8 DNA與殼聚糖的作用模型Fig.8 Action models ofDNA and chitosan

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Interaction of Chitosan with DNA and Effect of Am ino Group on Antibacterial Activity

L IXiao-fang1,FENG Xiao-qiang1,FU Guo-qing2,YANG sheng1＊,SU Zhong-xing3

1College of Life Science and Chem istry,Tianshui Nor m al University;2TraditionalM edical hospital of Tianshui,Tianshui 741001,China;3Chem istry and Chem ical Engineering College,Lanzhou University,Lanzhou 730000,China

The antibacterial activity of chitosan against Escherichia coli and Staphylococcus aureus were investigated by measuring inhibition zone.Aimed to explain the effect of amino group on antibacterial activity of chitosan,four different kinds of chitosan Schiff’s baseswere synthesized.UV absorption spectroscopy and electrochemical analysiswere used to illuminate the interaction of chitosan with DNA.The results showed that the antibacterial ability of chitosan was related to the amino group.Chitosan can bind with negative nucleic acids in cell,affect the normal replication function of DNA and ultimately inhibit the growth of bacteria.

chitosan;antibacterial activity;Schiff’s base;amino group;DNA

Q946.91;R285

A

1001-6880(2010)03-0373-06

2009-04-07 接受日期:2009-07-03

甘肅天水師范學院物理無機化學重點學科基金

＊通訊作者 Tel:86-532-88963253;E-mail:ysh@mail.tsnc.edu.cn