氮、磷對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng)、總脂及花生四烯酸積累的影響

羅夢(mèng)柳,桑 敏,張成武,李愛(ài)芬

暨南大學(xué)水生生物研究中心熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632

氮、磷對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng)、總脂及花生四烯酸積累的影響

羅夢(mèng)柳,桑 敏,張成武＊,李愛(ài)芬

暨南大學(xué)水生生物研究中心熱帶亞熱帶水生態(tài)工程教育部工程研究中心,廣州 510632

本文以缺刻緣綠藻 (Parietochloris incisa)為實(shí)驗(yàn)材料,研究了其在四種不同氮、磷濃度下的生長(zhǎng)、總脂(TL)及花生四烯酸(AA)含量的變化,分析測(cè)定了低氮和低磷濃度下脂肪酸的組成。結(jié)果表明:在BG-11培養(yǎng)基基礎(chǔ)上,氮濃度的改變對(duì)缺刻緣綠藻的生物量影響不明顯,不同氮濃度下的最終生物量均在 2.1 g·L-1左右。在低氮濃度下 TL和AA達(dá)到最大,分別為 33.37%(%干重)和 36.63%(%總脂肪酸,TFA),其中AA占藻體干重的 11.56%。不同磷濃度對(duì)缺刻緣綠藻的生長(zhǎng)有顯著影響,最終生物量在 0.90～2.07 g·L-1之間。TL在 8～20 mg·L-1的磷濃度范圍內(nèi)沒(méi)有明顯變化,為 28%左右。TL與氮、磷濃度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系,且低氮有利于AA的積累。

缺刻緣綠藻;氮濃度;磷濃度;脂肪酸;總脂;花生四烯酸

花生四烯酸 (Arachidonic acid,AA)是前列腺素、血栓烷素和白三烯的前體物質(zhì),也是母乳成分之一,具有重要的生物學(xué)功能[1,2]。AA的傳統(tǒng)來(lái)源是動(dòng)物的肝臟和魚(yú)油,但這些組織中 AA的含量很低,并且有異味,無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。

缺刻緣綠藻 (Parietochloris incisa)是一種單細(xì)胞綠藻,屬于 Trebouxiophyceae綱,1996年 Watanabe等在日本 Tateyama高山雪地中首次發(fā)現(xiàn)并分離報(bào)道[3]。研究證實(shí),缺刻緣綠藻含有豐富的 AA,在氮缺乏條件下,AA的含量為細(xì)胞干重的 21%,占細(xì)胞總脂肪酸(TFA)含量的 60%[4]。缺刻緣綠藻作為AA含量最高的微藻,不僅具有一般微藻生長(zhǎng)繁殖速度快,占地面積小易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn),尤為有利的是細(xì)胞中 90%以上的AA以三酰甘油酯形式貯藏,這為分離提供了有利條件,極有希望用于AA的商業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。近年來(lái),人們對(duì)缺刻緣綠藻的研究大多是關(guān)于 AA的合成代謝途徑[5-7]、細(xì)胞分子生物學(xué)[8-9]和培養(yǎng)條件[10-11]等方面。其中,氮饑餓和光強(qiáng)對(duì)AA積累的影響有較多報(bào)道,磷對(duì)其影響的報(bào)道則很少[6-8,11]。為此,本文以缺刻緣綠藻為材料,主要研究了不同氮磷濃度對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng), TL和AA積累的影響,以期為AA的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 藻種

缺刻緣綠藻 (Parietochloris incisa),暨南大學(xué)水生生物研究中心藻種庫(kù)保藏。

1.2 培養(yǎng)條件

采用BG-11培養(yǎng)基,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的藻細(xì)胞,接種于Φ6×60 cm柱狀光生物反應(yīng)器中,初始OD680為 0.2±0.05,補(bǔ)加 0.5%CO2的壓縮空氣鼓泡培養(yǎng),培養(yǎng)溫度為 23±1℃,熒光燈提供持續(xù)光照,光照強(qiáng)度約為 130μmol·m-2·s-1。

1.3 氮磷濃度的設(shè)置

以 BG-11培養(yǎng)基中的氮磷濃度為參照,在K2HPO4濃度為 40 mg·L-1的條件下,設(shè)置 NaNO3的濃度為 300 mg·L-1、500 mg·L-1、750 mg·L-1和1500 mg·L-1。在 NaNO3濃度為 1500 mg·L-1的條件下,設(shè)置 K2HPO4的濃度為 8 mg·L-1、13 mg· L-1、20 mg·L-1和 40 mg·L-1,每個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度設(shè)置 3個(gè)平行。

1.4 葉綠素 a的測(cè)定

葉綠素 a的測(cè)定參照文獻(xiàn)[12]的方法進(jìn)行。

1.5 干重的測(cè)定

取一定體積的藻液真空抽濾,在 80℃烘箱中烘至恒重,干燥器冷卻后稱重。

1.6 藻粉的制備

取一定量的藻液,3500 r/min離心,藻體用蒸餾水洗滌再離心,用ALPHR 2-4(德國(guó))冷凍干燥。凍干藻粉放入冰箱(-20℃)保存待用。

1.7 總脂含量的測(cè)定

參照 Khozin-Goldberg I[7]的方法進(jìn)行。準(zhǔn)確稱取一定量?jī)龈稍宸鄯湃霂菘诘牟Ａщx心管中,加入 2～4 mL二甲基亞砜甲醇溶液,40℃磁力攪拌 10 min,4℃再攪拌抽提 30 min,常溫 3500 r/min離心,轉(zhuǎn)移上清到一玻璃瓶中。剩下藻渣再加入乙醚-正己烷混合液 4℃攪拌抽提 1 h,離心并轉(zhuǎn)移上清到上述小瓶中?？芍貜?fù)上述過(guò)程直到藻渣變白。加入純水震蕩分相,移取有機(jī)相用氮?dú)獯抵梁阒亍?/p>

1.8 脂肪酸的分析

參照 Cohen Z[13]的方法進(jìn)行。稱取 25 mg凍干藻粉放入帶螺口的玻璃離心管中,加入 2 mL 2%的H2SO4無(wú)水甲醇:甲苯 (90:10,V/V),同時(shí)加入 25 μL 1%的十七烷酸 (C17:0),充氬氣后,80℃磁力攪拌 1.5 h,分別加入 1 mL純水和正己烷,震蕩后3500 r/min離心 3 min,將上層有機(jī)相轉(zhuǎn)移到一小玻璃瓶用氮?dú)獯蹈?加入 100μL正己烷密封,放入冰箱保存待測(cè)。

樣品經(jīng)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 (型號(hào)為 ThermoFinnigan TRACE GC-MS)分析。利用內(nèi)標(biāo)標(biāo)定各脂肪酸出峰時(shí)間和順序,面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)百分含量。

1.9 數(shù)據(jù)處理

用 SPSS13.0單因素方差分析 (ANOVA)中的LSD多重比較進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮、磷濃度對(duì)缺刻緣綠藻生長(zhǎng)的影響

在磷酸鹽濃度一定的條件下,培養(yǎng)基不同氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻葉綠素 a和干重的影響見(jiàn)圖 1(左列)。由圖 1可以看出,在 14 d的培養(yǎng)過(guò)程中,不同氮濃度下培養(yǎng)液葉綠素 a含量在接種后 6 d沒(méi)有差別。隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)液葉綠素 a的含量與氮濃度呈正相關(guān)關(guān)系。300 mg·L-1氮濃度實(shí)驗(yàn)組到達(dá)平臺(tái)穩(wěn)定期的時(shí)間最短,葉綠素 a的含量明顯低于其它三個(gè)實(shí)驗(yàn)組,最高時(shí)僅為 14.79 mg·L-1。其它三個(gè)氮濃度實(shí)驗(yàn)組到達(dá)穩(wěn)定期的時(shí)間隨氮濃度的增大而延長(zhǎng),葉綠素 a含量增加,在 NaNO3濃度為 1500 mg·L-1時(shí),葉綠素 a含量最高達(dá)到 42.03 mg·L-1。不同氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻的干重影響不明顯。低氮濃度的最終生物量為 2.05 g·L-1,最大干重增加量為 1.98 g·L-1。NaNO3濃度為 1500 mg ·L-1時(shí),干重最大達(dá)到 2.4 g·L-1,最大干重增加量為 2.29 g·L-1。

培養(yǎng)基中的硝酸鹽濃度不變,在不同磷濃度條件下,缺刻緣綠藻葉綠素 a和干重的變化見(jiàn)圖 1(右列)。磷濃度不同,藻液的葉綠素 a含量在接種后 2天內(nèi)沒(méi)有差別。磷濃度在 8～20 mg·L-1范圍內(nèi),藻液葉綠素 a的含量差別不明顯,隨培養(yǎng)基中磷濃度的進(jìn)一步提高,葉綠素 a含量迅速增大,當(dāng) K2HPO4濃度為 40 mg·L-1時(shí),葉綠素 a含量達(dá)到最高,為30.11 mg·L-1,比低磷實(shí)驗(yàn)組增加了 83.18%。缺刻緣綠藻的生物量與培養(yǎng)液的磷濃度呈正相關(guān),隨磷濃度的增加,最終干重分別為 0.9 g·L-1、1.38 g ·L-1、1.64 g·L-1和 2.07 g·L-1。最大干重增加量分別為 0.83 g·L-1、1.30 g·L-1、1.52 g·L-1和 1.96 g·L-1。以上結(jié)果說(shuō)明磷限制對(duì)生物量的影響比氮限制更為明顯。

圖 1 缺刻緣綠藻在不同氮濃度(左列)和磷濃度下(右列)的葉綠素 a(上排)和干重(下排)Fig.1 Chl.a content(up)and dryweight(down)ofParietochloris incisacultures under the different nitrogen(left)and phosphorus concentration(right)

2.2 不同氮、磷濃度對(duì)缺刻緣綠藻總脂含量的影響

圖 2 缺刻緣綠藻在不同氮濃度(左列)和磷濃度下(右列)的總脂含量(上排)和單位體積總脂產(chǎn)量(下排)Fig.2 Total lipids(up)and volumetric productivityof total lipids(down)inParietochloris incisacultures after 14 days under the different nitrogen(left)and phosphorus concentration(right)

圖 2是缺刻緣綠藻在不同氮磷濃度下的總脂(TL)含量和單位體積總脂產(chǎn)量。從圖中可以看出,不同氮磷濃度實(shí)驗(yàn)組的 TL含量都隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,各實(shí)驗(yàn)組在培養(yǎng)前期 TL增加不明顯,從穩(wěn)定期開(kāi)始 TL明顯增加。TL含量與氮磷濃度呈負(fù)相關(guān),且氮濃度的影響更顯著,能獲得更高的 TL。四個(gè)不同氮濃度實(shí)驗(yàn)組 TL的最終含量分別為33.37%,29.63%,21.75%和 20.89%,最大總脂收獲量分別為 0.69 g·L-1,0.65 g·L-1,0.49 g·L-1和0.5 g·L-1。從圖中還可以看出,在一定的較低氮濃度范圍內(nèi),TL的含量接近,NaNO3的濃度在 300～750 mg·L-1時(shí),TL的含量都較高。這個(gè)結(jié)果說(shuō)明低氮濃度有利于 TL的積累。在氮濃度固定磷濃度不同的條件下,不同實(shí)驗(yàn)組 TL的最終含量分別為29.57%,28.48%,26.5%和 18.91%,最大總脂收獲量分別為 0.27 g·L-1、0.39 g·L-1、0.43 g·L-1和0.39 g·L-1。K2HPO4濃度為 40 mg·L-1實(shí)驗(yàn)組的TL最低,其它三個(gè)實(shí)驗(yàn)組的 TL含量接近,都可以獲得較高的 TL。缺刻緣綠藻的單位體積總脂產(chǎn)量在低磷濃度時(shí)最低,為 25.42 mg·L-1。這是由于藻細(xì)胞生長(zhǎng)受到磷的限制,生物量很低,雖然可獲得較高的 TL,但最終單位體積總脂產(chǎn)量較低。而在 300 mg ·L-1低氮濃度下,獲得缺刻緣綠藻的單位體積總脂產(chǎn)量最高,為 67.14 mg·L-1。

2.3 不同氮、磷濃度對(duì)缺刻緣綠藻花生四烯酸含量的影響

實(shí)驗(yàn)分析了BG-11培養(yǎng)基濃度和低氮、低磷條件下缺刻緣綠藻藻粉的主要脂肪酸組成,結(jié)果見(jiàn)表1。由表 1可知,缺刻緣綠藻含有多種脂肪酸,除軟脂酸 (16∶0)和硬脂酸 (18∶0)等飽和脂肪酸的含量較高外,還有其它多不飽和脂肪酸,其中不飽和脂肪酸的含量占總脂肪酸 (TFA)的 81%。不飽和脂肪酸中花生四烯酸 (20∶4ω6)含量最高,其次是油酸(18∶1)。在低氮條件下,缺刻緣綠藻的 AA含量最高,占 TFA的 36.63%,藻粉中 AA含量可達(dá)干重的11.56%,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于BG-11培養(yǎng)基氮濃度下的 4.01% (見(jiàn)圖3)。低磷濃度下AA分別占 TFA和藻體干重的15.2%和 4.43%,明顯低于BG-11培養(yǎng)基磷濃度下的23.54%和4.01%,也低于油酸的含量 31.34%,這說(shuō)明低磷條件下大部分油酸還未轉(zhuǎn)化為AA。

表 1 缺刻緣綠藻在不同氮磷濃度下的脂肪酸組成和含量Table 1 Fatty acids composition of lipids ofParietochloris incisaat different concentration of nitrogen and phosphorus

圖 3 缺刻緣綠藻在不同氮濃度(左)和磷濃度下(右)的花生四烯酸含量Fig.3 Production of arachidonic acid(AA)contentofParietochloris incisaunder the different nitrogen(left)and phosphorus concentration(right)

3 討論

氮和磷是微藻生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)因子,是維持細(xì)胞生長(zhǎng)必需的。在氮缺乏狀態(tài)下,微藻光合作用會(huì)受到影響,體內(nèi)蛋白質(zhì)合成停止并導(dǎo)致細(xì)胞分裂減緩,生長(zhǎng)速率下降[14]。本實(shí)驗(yàn)中氮濃度對(duì)缺刻緣綠藻葉綠素 a含量的影響明顯,且與氮濃度呈正相關(guān)。但不同氮濃度下的最終生物量干重差別不明顯,說(shuō)明實(shí)驗(yàn)的最低氮濃度 300 mg·L-1沒(méi)有限制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。微藻在缺氮時(shí)同化產(chǎn)物多轉(zhuǎn)化為糖類或脂類物質(zhì),通常會(huì)增加飽和脂肪酸的含量。梁英[15]的研究表明三角褐指藻在處于氮饑餓狀態(tài)下,PUFA和 EPA的含量下降。而本實(shí)驗(yàn)在低氮濃度下缺刻緣綠藻的總脂含量和花生四烯酸含量分別為 33.37%和 36.63%,比正常氮濃度下增加了 59.7%和55.6%。缺刻緣綠藻的不飽和脂肪酸占 TFA的81%左右,這個(gè)結(jié)果與劉建國(guó)等[11]的測(cè)定結(jié)果一致。在低氮濃度下,缺刻緣綠藻 AA占 TFA的36.63%,這與Bigogno C等的報(bào)道相近,但花生四烯酸的含量卻明顯低于文獻(xiàn)報(bào)道的 60%的水平[4]。究其原因主要是光照強(qiáng)度和氮濃度的影響,光照強(qiáng)度的提高和氮饑餓又有利于AA的積累[11]。

培養(yǎng)基中的磷是藻類合成葉綠素所必需的,同時(shí)參與碳水化合物的代謝及脂肪酸的轉(zhuǎn)化。本實(shí)驗(yàn)在低磷濃度下,接種 3 d后出現(xiàn)明顯的磷限制現(xiàn)象,隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),不同磷濃度實(shí)驗(yàn)組的葉綠素a,干重,總脂的差距越來(lái)越顯著。這是由于隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),培養(yǎng)液中的磷逐漸被消耗,而在培養(yǎng)的前幾天,微藻可以儲(chǔ)存,在細(xì)胞質(zhì)中形成多聚磷顆粒[15],在磷缺乏時(shí),保持磷元素的供應(yīng)。低磷濃度限制了缺刻緣綠藻的生長(zhǎng),但卻有利于總脂的提高。

4 結(jié)論

氮和磷限制都有利于缺刻緣綠藻總脂的積累,且氮限制明顯。在低氮條件下可獲得較高的花生四烯酸含量,低磷濃度不利于缺刻緣綠藻花生四烯酸的積累。

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Effects of Nitrogen and Phosphorus on the Growth,Total Fatty Acids and Arachidon ic Acid Production ofParietochloris incisa

LUO Meng-liu,SANGMin,ZHANG Cheng-wu＊,L IAi-fen
Institute of Hydrobiology,Jinan University,Engineering Research Center of Tropical and SubtropicalAquatic Ecological Engineering,M inistry of Education,Guangzhou 510632,China

The green freshwatermicroalgaParietochloris incisais known as the richest plant source ofAA.The effects of nitrogen and phosphorus concentrations on the growth,total lipids(TL)and arachidonic acid(AA)content inP.incisawere studied.The results showed that nitrogen concentrations has no obvious influence on the growth ofP.incisaand the final biomass stable at 2.1 g·L-1under different nitrogen concentrationswhen phosphorus concentration fixed.The TL reached maximum to 33.37%of dryweight,and the proportion of AA comprising 36.63%of total fatty acids(TFA) and 11.56%of dryweight under low nitrogen concentration.When nitrogen concentration is fixed,phosphorus concentration has significant influence on the growth ofP.incisa.The final biomass ranged from 0.90 to 2.07 g·L-1.TL achieved about 28%when the phosphorus concentrations increased from 8 to 20 mg·L-1.It is demonstrated by the statistical analysis that the TL contents negatively correlated to nitrogen and phosphorus concentration.

Parietochloris incisa;Nitrogen concentration;Phosphorus concentration;Fatty acids;Total lipids;Arachidonic acid.

Q949.21;Q17

A

1001-6880(2010)03-0378-05

2010-03-15 接受日期:2010-05-21

國(guó)家“863”計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目 (2009AA064401);珠海市科技局項(xiàng)目(PC20081008)

＊通訊作者 Tel:86-20-85222025;E-mail:tzhangcw@jnu.edu.cn