SUMO-1在HIF-1/VEGF信號(hào)通路中作用

薛慶於,韓 野,郭聯(lián)和,王 俊,于智勇,王君,沈維干

(1.揚(yáng)州職業(yè)大學(xué)生化工程系,江蘇揚(yáng)州,225000;2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院,江蘇 揚(yáng)州,225001)

泛素系統(tǒng)和其對(duì)蛋白質(zhì)翻譯后的修飾作用的影響是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)功能調(diào)節(jié)的關(guān)鍵信號(hào)通路。與泛素化修飾引起靶蛋白降解不同,真核細(xì)胞中存在一種小的類(lèi)泛素修飾因子-1(SUMO-1),其對(duì)蛋白質(zhì)的修飾作用是調(diào)節(jié)細(xì)胞中蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用和轉(zhuǎn)錄活性、增強(qiáng)底物的穩(wěn)定性或影響靶蛋白亞細(xì)胞定位[1-3]?；蛐酒芯拷Y(jié)果顯示,缺氧培養(yǎng)的細(xì)胞中SUMO-1 mRNA的表達(dá)表現(xiàn)為時(shí)間依賴(lài)性的增加[4]。缺氧應(yīng)激研究發(fā)現(xiàn),許多SUMO-1的底物與轉(zhuǎn)錄或者翻譯后的調(diào)節(jié)相關(guān),這些底物包括 p53、Mdm2、c-jun、Glut-1和Glut-4等,提示SUMO-1在缺氧應(yīng)答中扮演重要角色[4-5]。

細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激的直接反應(yīng)之一是在細(xì)胞內(nèi)積聚缺氧誘導(dǎo)因子-1(HIF-1)。HIF-1是由HIF-1α和HIF-1β亞單位組成的異二聚體。在正常氧供應(yīng)的環(huán)境中,HIF-1α通過(guò)泛素化/蛋白酶體途徑降解;在缺氧時(shí),HIF-1α與HIF-1β形成穩(wěn)定異二聚體轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中,與許多基因(如VEGF、纖溶酶原活化蛋白抑制基因等)的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子區(qū)域的缺氧反應(yīng)元件結(jié)合,從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)與血管生成、糖代謝等過(guò)程相關(guān)的基因的表達(dá),表現(xiàn)為多方位、多途徑的調(diào)節(jié)作用[6]。

盡管類(lèi)泛素化修飾作用的生物化學(xué)和酶學(xué)已經(jīng)被揭示,但是絕大多數(shù)的報(bào)道僅集中在SUMO-1如何識(shí)別和與靶蛋白相互作用,有關(guān)SUMO-1表達(dá)的調(diào)節(jié)和其功能的實(shí)施在體內(nèi)外仍然了解很少,特別是對(duì)于SUMO-1在低氧或缺氧環(huán)境下與HIF-1以及由HIF-1引起的下游信號(hào)通路的作用尚無(wú)確切的報(bào)道。本研究主要研究SUMO-1在低氧應(yīng)激過(guò)程中對(duì)HIF-1α表達(dá)以及對(duì)依賴(lài)于HIF-1的基因轉(zhuǎn)錄激活的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pGL-VEGF/K(含有VEGF啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列的表達(dá)熒光素酶的報(bào)告質(zhì)粒)、pGL-VEGF/P(缺乏HRE的表達(dá)熒光素酶的報(bào)告質(zhì)粒)、pGL-HREmut(含有突變位點(diǎn)的HRE的表達(dá)熒光素酶的報(bào)告質(zhì)粒)和pGL-HRE(僅含有HRE的表達(dá)熒光素酶的報(bào)告質(zhì)粒)由美國(guó)NIH的Gutkind教授惠贈(zèng)[7]。pcDNA3.1-SUMO-1、pEGFP-C3 、β-半乳糖苷酶報(bào)告質(zhì)粒(β-gal)和HEK293細(xì)胞為本實(shí)驗(yàn)室保存。膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司,小牛血清購(gòu)自杭州四季清生物工程材料有限公司,DMEM購(gòu)自Gibico公司,鼠抗人HIF-1α和 α-tubulin單克隆抗體和兔抗鼠IgG抗體購(gòu)自Santa cruz公司,限制性?xún)?nèi)切酶EcoR I、Hind III和T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品,脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitrogen公司,低氧培養(yǎng)盒購(gòu)自中國(guó)長(zhǎng)沙長(zhǎng)錦科技有限公司;低氧混合氣(1%O2、5%CO2和平衡N2)購(gòu)自南京特種氣體廠(chǎng)。

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建pEGFP-C3-SUMO-1真核表達(dá)質(zhì)粒按照文獻(xiàn)報(bào)道的方式[8],用限制性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ、HindⅢ酶切質(zhì)粒pcDNA3.1-SUMO-1,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、DNA膠純化試劑盒純化目的基因片段,獲得人SUMO-1目的基因,并亞克隆到表達(dá)載體pEGFP-C3的相應(yīng)酶切位點(diǎn)中得到pEGFP-C3-SUMO-1真核表達(dá)質(zhì)粒。

1.2.2 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選:HEK293細(xì)胞接種到6孔板中,培養(yǎng)于含10%小牛血清、100 mg/L青霉素和1 000 U/L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中,在37℃,含5%CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法,按照說(shuō)明書(shū)操作分別轉(zhuǎn)染pEGFP-C3和pEGFP-C3-SUMO-1到培養(yǎng)的相應(yīng)的HEK293細(xì)胞中,培養(yǎng)48 h后通過(guò)G418抗性法篩選穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細(xì)胞系,G418濃度為300 mg/L。用熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效果。

1.2.3 免疫印跡檢測(cè):對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá) GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細(xì)胞,常氧和低氧培養(yǎng)24 h后,分別用預(yù)冷的PBS洗2次,吸干所有液體,加細(xì)胞裂解緩沖液(臨用前補(bǔ)加2 mmol/L PMSF和 cocktail),冰浴30 min后,1 2000 g離心10 min,取上清。采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量,加入樣品緩沖液,99℃處理 5 min,加樣到 8%SDS PAGE,按常規(guī)方法轉(zhuǎn)印至PVDF膜,隨后用含3%BSA的PBS進(jìn)行封閉1 h,與一抗孵育,4℃過(guò)夜,分別用PBS-Tween 20洗膜3次,每次10 min,用堿性磷酸酶結(jié)合的二抗室溫孵育2 h,用含有NBT和BCIP的堿性磷酸酶緩沖液顯色。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4 熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和檢測(cè):細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染采用常規(guī)磷酸鈣沉淀方法,分別用相應(yīng)的報(bào)告質(zhì)粒pGL-VEGF/K、pGL-VEGF/P、pGLHREmut或 pGL-HRE(每孔 1.5 μ g)與 β-gal(作為內(nèi)標(biāo),每孔0.5 μ g)共轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細(xì)胞,過(guò)夜培養(yǎng)后用PBS洗細(xì)胞2次,更換培養(yǎng)液,分別在常氧和低氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。低氧培養(yǎng)時(shí),將細(xì)胞置于密封的低氧培養(yǎng)盒中,用低氧混合氣平衡10 min(1 L/min),然后轉(zhuǎn)移到37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用Promega公司提供的試劑盒,按照說(shuō)明書(shū)操作,檢測(cè)細(xì)胞裂解液中熒光素酶的活性;用鄰-硝基苯-β-D半乳糖苷(ONPG)為底物,檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性作為對(duì)照(轉(zhuǎn)染效率),計(jì)算熒光素酶的活性,并與對(duì)照組相比,計(jì)算并比較變化的倍數(shù),每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:采用SPSS 11.0統(tǒng)計(jì)軟件的One-way ANOVA程序進(jìn)行單因素方差分析,進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,結(jié)果以(±s)表示,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 SUMO-1與GFP融合基因在HEK293細(xì)胞中的表達(dá)

pEGFP-C3和pEGFP-C3-SUMO-1轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,經(jīng)G418篩選后的建立穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFPC3的細(xì)胞中GFP分布于整個(gè)細(xì)胞,而轉(zhuǎn)染pEGFP-SUMO-1的細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)集中于細(xì)胞核中(圖1)。

圖1 SUMO-1基因在HEK293細(xì)胞中的表達(dá) (200倍)

2.2 低氧可以上調(diào)SUMO-1的表達(dá)

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HEK293細(xì)胞,經(jīng)常氧和低氧培養(yǎng)24 h后,免疫印跡結(jié)果由圖2可見(jiàn),與常氧培養(yǎng)相比,低氧可以上調(diào)HEK293細(xì)胞中SUMO-1蛋白的表達(dá)。

圖2 Western blot檢測(cè)HEK293細(xì)胞中SUMO-1的表達(dá)

2.3 SUMO-1可以上調(diào)HIF-1α的表達(dá)

HEK293細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá) GFP和 GFPSUMO-1的HEK293細(xì)胞,在低氧培養(yǎng)盒中培養(yǎng)24 h后,裂解細(xì)胞,經(jīng)定量分析后的細(xì)胞裂解液與SDS-PAGE上樣緩沖液混勻處理后,電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體結(jié)合并檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3可見(jiàn),穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1的HEK293細(xì)胞中的HIF-1α的表達(dá)量與未轉(zhuǎn)染(空白對(duì)照組)和轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的HEK293細(xì)胞中的表達(dá)量相比顯著提高。

2.4 SUMO-1可以上調(diào)HEK293細(xì)胞中HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性

應(yīng)用一系列的 VEGF-Luc報(bào)告質(zhì)粒(pGLVEGF/K 、pGL-VEGF/P 、pGL-HREmut和 pGLHRE)分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細(xì)胞,并進(jìn)行低氧和常氧培養(yǎng)24 h后的實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖4可見(jiàn),在常氧和低氧培養(yǎng)時(shí),穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1的HEK293細(xì)胞(C)組與空白對(duì)照組(未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,A)和穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞(轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的細(xì)胞,B)相比,pGL-VEGF/K和pGL-HRE轉(zhuǎn)染后表達(dá)的熒光素酶報(bào)告基因活性明顯增高,而A、B組細(xì)胞無(wú)論常氧培養(yǎng)還是低氧培養(yǎng),兩組之間相比均無(wú)顯著性差異。穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1的細(xì)胞(C)在pGL-VEGF/P和pGL-HREmut轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中熒光素酶報(bào)告基因活性,無(wú)論在常氧培養(yǎng)還是低氧培養(yǎng)時(shí),與空白對(duì)照組(A)和穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞組(C)相比均無(wú)顯著性差異。

圖3 Western blot檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞的HIF-1α的表達(dá)

圖4 SUMO-1對(duì)依賴(lài)于HIF-1的熒光素酶報(bào)告基因表達(dá)的影響

3 討 論

缺氧與許多生理和病理過(guò)程密切相關(guān)。腫瘤的生長(zhǎng)、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過(guò)程依賴(lài)于血管新生,依靠新生血管來(lái)提供營(yíng)養(yǎng)(包括氧氣)和排泄廢物。在缺乏新生血管的情況下,腫瘤通常在長(zhǎng)到幾毫米后由于缺氧而停止生長(zhǎng)[9]。細(xì)胞對(duì)低氧應(yīng)激的直接反應(yīng)之一是在細(xì)胞內(nèi)積聚轉(zhuǎn)錄因子HIF-1,在細(xì)胞對(duì)環(huán)境條件的應(yīng)答調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用[4,9]。低氧應(yīng)激的小鼠的腦組織和心臟組織中SUMO-1的表達(dá)上調(diào),而這種上調(diào)可以在體內(nèi)調(diào)節(jié)HIF-1α的功能[10]。HIF-1參與細(xì)胞內(nèi)的多種生物學(xué)過(guò)程,包括血管生成、能量代謝以及細(xì)胞存活等。HIF-1有對(duì)氧氣敏感的HIF-1α以及對(duì)氧氣不敏感的HIF-1β組成,而 HIF-1α需經(jīng)歷翻譯后的修飾,如羥基化修飾、泛素化修飾、乙酰化修飾來(lái)調(diào)節(jié)其穩(wěn)定性。由SUMO-1介導(dǎo)的HIF-1α的翻譯后的修飾,可以穩(wěn)定HIF-1α的穩(wěn)定性,但是對(duì)其轉(zhuǎn)錄活性的影響的報(bào)道結(jié)果不一,有研究認(rèn)為HIF-1α的翻譯后的SUMO修飾并不影響HIF-1α的降解,HIF-1α與 SUMO共價(jià)結(jié)合,會(huì)導(dǎo)致HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性下降[11],而另外的研究則認(rèn)為SUMO-1對(duì)HIF-1α的翻譯后修飾,可以穩(wěn)定并上調(diào)的表達(dá),增加HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性[12]。

本研究首先應(yīng)用表達(dá)SUMO-1與GFP融合基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并篩選穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系,熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pEGFP-C3的細(xì)胞中 GFP分布于整個(gè)細(xì)胞,而轉(zhuǎn)染pEGFP-SUMO-1的細(xì)胞中融合蛋白的表達(dá)集中于細(xì)胞核中,明確了SUMO-1的核定位。通過(guò)低氧處理HERK293細(xì)胞,結(jié)果顯示,低氧可以上調(diào)細(xì)胞中SUMO-1蛋白的表達(dá),這與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是一致的[4,10]。利用篩選和建立的穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1細(xì)胞系,通過(guò)低氧培養(yǎng),結(jié)果顯示,穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1的HEK293細(xì)胞中的HIF-1α的表達(dá)量與空白對(duì)照組以及穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞中的表達(dá)量相比顯著提高,說(shuō)明在低氧應(yīng)激過(guò)程中SUMO-1可以穩(wěn)定或者上調(diào)HIF-1α。

為了證明在低氧應(yīng)激過(guò)程中,SUMO-1穩(wěn)定或者上調(diào)HIF-1α,是否會(huì)影響HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性,本研究應(yīng)用一系列含有VEGF啟動(dòng)子的不同缺失突變體的 VEGF-Luc報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞、穩(wěn)定表達(dá)GFP和GFP-SUMO-1的HEK293細(xì)胞,并進(jìn)行低氧和常氧培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在常氧和低氧培養(yǎng)時(shí),轉(zhuǎn)染含有VEGF啟動(dòng)子全長(zhǎng)序列的報(bào)告質(zhì)粒(pGL-VEGF/K)和僅含有完整HRE的報(bào)告質(zhì)粒(pGL-HRE)的穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1的HEK293細(xì)胞中的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)與空白對(duì)照組以及穩(wěn)定表達(dá)GFP的細(xì)胞中相比明顯增高,尤以低氧培養(yǎng)時(shí)更加顯著;而轉(zhuǎn)染缺乏HRE的VEGF啟動(dòng)子序列的報(bào)告質(zhì)粒(pGL-VEGF/P)和含有HRE突變位點(diǎn)的報(bào)告質(zhì)粒(pGL-HREmut)的穩(wěn)定表達(dá)SUMO-1的細(xì)胞中的熒光素酶報(bào)告基因的表達(dá)無(wú)論在常氧培養(yǎng)還是低氧培養(yǎng)時(shí),與對(duì)照組相比均無(wú)顯著差異。這些結(jié)果說(shuō)明,在低氧應(yīng)激培養(yǎng)條件下,SUMO-1可以明顯上調(diào)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性,而且這種轉(zhuǎn)錄上調(diào)的機(jī)制是通過(guò)促進(jìn)HIF-1與HRE序列的結(jié)合。

盡管SUMO-1修飾作用的生物化學(xué)和酶學(xué)已經(jīng)被揭示[13],但是絕大多數(shù)的報(bào)道僅集中在SUMO-1如何識(shí)別和與靶蛋白相互作用,有關(guān)SUMO-1表達(dá)的調(diào)節(jié)和其功能的實(shí)施在體內(nèi)外仍然了解很少,特別是對(duì)于SUMO-1在低氧或缺氧環(huán)境下與HIF-1以及由HIF-1引起的下游信號(hào)通路的作用尚無(wú)確切的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,低氧可以上調(diào)SUMO-1的表達(dá),SUMO-1過(guò)表達(dá)可以上調(diào)HIF-1α表達(dá),當(dāng)然這種上調(diào)是是否是通過(guò)直接抑制HIF-1α的泛素化降解來(lái)實(shí)現(xiàn)的,還有待于進(jìn)一步研究,但是本研究結(jié)果進(jìn)一步明確SUMO-1可以通過(guò)促進(jìn)HIF-1與HRE序列的結(jié)合而上調(diào)HIF-1的轉(zhuǎn)錄活性。

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