HPLC法測定雷公藤片中雷公藤甲素的含量

王艷芝

（吉林省雙遼市中醫(yī)院藥劑科，吉林雙遼 136400）

雷公藤提取物為雷公藤根的醋酸乙酯提取物。本品為棕色的塊狀物或粉末；氣微香，味微苦。取本品約10 mg，加乙醇15ml使溶解；加堿性二硝基苯甲酸試液0.5 ml，即顯紅色。雷公藤片含雷公藤甲素，有抗感染和免疫抑制作用，適用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎活動期。每次10～20 mg，3次/d，1個(gè)月為1個(gè)療程。病情控制后減量、停藥，采用間歇治療。筆者采用HPLC法測定雷公藤片中雷公藤甲素的含量，研究結(jié)果表明，雷公藤甲素在此條件下分離較好，檢測靈敏度高，測定專屬性強(qiáng)。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HP1100高效液相色譜儀；在線脫氣機(jī)；四元泵；二極管陣列檢測器；HP1100化學(xué)工作站；Agilent G1313ALS自動進(jìn)樣器；METTLER電子分析天平；simplicity-185超純水器。

1.2 試藥

雷公藤片（批號：091243，北京同仁堂公司）；雷公藤甲素（批號：100021-200817，中國藥品生物制品檢定所）；乙腈為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Diamonsil-C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（60∶40）；檢測波長：218 nm；流速：1.3 ml/min。 柱溫：35℃；進(jìn)樣量：10 μl；理論塔板數(shù)按雷公藤甲素計(jì)不低于3 000。

2.2 對照品溶液的制備

取雷公藤甲素對照品適量，精密稱定，加甲醇溶液制成每毫升含0.023 8 mg的溶液作為對照品貯備液。精密吸取對照品貯備液4 ml置10 ml量瓶中，加甲醇溶液定容至刻度，作為對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取雷公藤片30片，研碎后取10片量，加氯仿10 ml，超聲10 min，加中性氧化鋁1 g，攪拌均勻，蒸干，上中性氧化鋁柱，以醋酸乙酯溶液洗脫，收集洗脫液150 ml，蒸干，殘?jiān)蛹状既芤菏谷芙猓ㄈ葜?0 ml作為供試品溶液。

2.4 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取雷公藤甲素對照品溶液、陰性溶液和供試品溶液，按上述色譜條件進(jìn)行試驗(yàn)，考察系統(tǒng)適用性。HPLC色譜圖見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

分別精密量取“2.2”項(xiàng)下雷公藤甲素對照品貯備液1、2、4、6、8、10 ml，分別置 10 ml量瓶中，加甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別吸取20 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件測定色譜峰面積，以對照品進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明雷公藤甲素進(jìn)樣量在0.047 6～0.476 0 μg范圍內(nèi)，呈良好的線性關(guān)系。回歸方程為Y=2 110.8X+3.7（r=0.999 1）。

2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下對照品溶液20 μl，重復(fù)進(jìn)樣 5次，按上述色譜條件測定色譜峰峰面積，RSD為1.84%，結(jié)果表明本法精密度良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液，分別于放置 0、2、4、6、8、12 h后，注入液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，RSD為2.39%，結(jié)果表明供試品溶液在12 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.8 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備5份供試品溶液，分別測定色譜峰面積，計(jì)算得平均含量為11.48 μg/g，RSD=1.36%（n=6）。結(jié)果表明本法重復(fù)性良好。

2.9 回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品6份，加入雷公藤甲素對照品溶液（0.050 48 mg/ml）1 ml，加入氯仿 10 ml，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，照“2.1”項(xiàng)下方法測定雷公藤甲素色譜峰，測得平均回收率為99.08%，RSD=0.75%，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.1 Resultsof recovery test(n=6)

2.10 樣品含量測定

取本品30片，稱定重量，研碎，精密稱取10片量，按“2.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，精密吸取樣品溶液 20 μl，依“2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（%，n=3）Tab.2 Content determination results of samples(%,n=3)

3 討論

雷公藤片既有抗感染作用，又有免疫抑制作用。目前其他的抗風(fēng)濕藥沒有免疫抑制作用，而免疫抑制藥又沒有抗感染作用，而雷公藤兩者均具有。同時(shí)對胃的刺激又比其他的抗風(fēng)濕藥小，細(xì)胞毒作用比其他的免疫抑制劑（如磷酰胺）安全。所以說雷公藤是一個(gè)不可多得具有很高價(jià)值的中國獨(dú)創(chuàng)的新藥。本研究通過照薄層色譜法試驗(yàn)，測定雷公藤片中其主要藥理作用的雷公藤甲素進(jìn)行含量分析，效果較好。吸取供試品溶液、對照品溶液，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以氯仿-乙醚為展開劑，展開，取出，晾干，噴以堿性二硝基苯甲酸試液，照薄層色譜法進(jìn)行掃描，測量供試品吸收度積分值與對照品吸收度積分值，計(jì)算，即得。本品按片計(jì)，含雷公藤甲素（C20H24O6）不少于0.1%，此方法可以作為雷公藤片中雷公藤甲素的檢測。

[1]中華人民共和國衛(wèi)生部.藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑[S].16冊.北京:中國醫(yī)藥出版社,1993:113.

[2]常雪靈,陳華兵,徐輝碧.反相高效液相色譜測定雷公藤浸膏甲素的含量[J].分析科學(xué)學(xué)報(bào),2003,19(4):327.

[3]陳婭蘭,魯艷柳,何明三.RP-HPLC法測定雷公藤雙層片中雷公藤甲素含量的研究[J].湖北中醫(yī)雜志,2005,27(4):54-55.

[4]羅明珠,李進(jìn).薄層掃描法及高效液相色譜法測定雷公藤甲素含量的比較[J].中國醫(yī)院藥學(xué)雜志,1996,16(2):76-77.

[5]池玉梅,文紅梅.HPLC法測定雷公藤飲片中雷公藤甲素的含量[J].南京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2001,17(1):32-33.

[6]Yang Huanjie,Chen Di,Cui Qiuzhi,et al.Celastol,a triterpene extracted from the chinese thunder of god vine is a proteasome inhibitor and suppresses human prostate cancer growth in nude mice[J].Cancer Res,2006,66(9):4758.

[7]夏焱,王文燕,張彥文.HPLC法測定雷公藤及其片劑中雷公藤紅素[J].中草藥,2005,36(8):1154.

[8]Li J,Chen F,Liu GF,et al.Determination of triptolide in leigongteng heji by TLCS[J].Prac Med Tech,2004,11(8A):1430.