一株產(chǎn)淀粉酶的克雷伯氏菌株的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化＊

俞曉霞,沈燕霞,張玲龍,錢 坤,采克俊

(湖州師范學院生命科學學院,浙江湖州313000)

一株產(chǎn)淀粉酶的克雷伯氏菌株的分離鑒定及其產(chǎn)酶條件優(yōu)化＊

俞曉霞,沈燕霞,張玲龍,錢 坤,采克俊

(湖州師范學院生命科學學院,浙江湖州313000)

從酒釀、酒曲樣品中,采用透明圈法對淀粉酶產(chǎn)生菌株進行初篩,并通過測定酶活對其進行復篩.對所篩選出的產(chǎn)淀粉酶能力較高的菌株進行形態(tài)特征觀察、生理生化鑒定及16S rDNA序列測定.經(jīng)鑒定是克雷伯氏菌屬,將其命名為Klebsiella sp.ZSY-I.通過正交實驗對該菌株產(chǎn)酶的影響因素進行優(yōu)化,結果表明:對菌株產(chǎn)酶影響較大的因素依次為KNO3、溫度、淀粉和p H.該菌株在淀粉含量為2.5%,KNO3含量為1.25%的培養(yǎng)基上,30℃和初始p H為7.5,培養(yǎng)24 h后,酶活力達到最高為14.66 U/mL.

淀粉酶;克雷伯氏菌;分離;鑒定;優(yōu)化

淀粉酶(Amylase)是催化淀粉水解轉化成葡萄糖、麥芽糖及其它低聚糖的一群酶的總稱.包括α-淀粉酶、β-淀粉酶、葡萄糖淀粉酶和異淀粉酶四類.淀粉酶大量用于糧食加工、食品工業(yè)、釀造、發(fā)酵、紡織品工業(yè)和醫(yī)藥行業(yè)[1].早在19世紀50年代,人類就已利用高溫與中溫淀粉酶的作用從事釀酒、制飴糖等[2～4].

目前,國外已初步搞清了產(chǎn)α-淀粉酶的調(diào)控基因,并將枯草芽孢桿菌重組體的基因引入生產(chǎn)菌株,使α-淀粉酶產(chǎn)量提高數(shù)倍甚至數(shù)十倍[5].近年來,我國的酶制劑工業(yè)有了蓬勃的發(fā)展,品種和產(chǎn)量也不斷增加,但與國外酶制劑行業(yè)相比尚有一定的差距,并且我國酶劑型和菌株都較單一,還不能適合國民經(jīng)濟發(fā)展的需要,需進一步篩選出新的具有優(yōu)良性質(zhì)的淀粉酶產(chǎn)生菌株和提高酶制劑的產(chǎn)量.

本實驗從酒釀、酒曲樣品中篩選出一株產(chǎn)淀粉酶能力較高的克雷伯氏菌株,并對其發(fā)酵條件進行優(yōu)化,提高其產(chǎn)酶能力,為進一步利用這些野生型菌株進行初步的研究.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

樂購超市湖州店所售的甜酒釀和湖州市農(nóng)貿(mào)市場所售的酒曲.

1.1.2 主要試劑和儀器

PCR純化試劑盒為axygen(愛思進)公司生產(chǎn).瓊脂、碘、碘化鉀、可溶性淀粉等均為國產(chǎn)分析純.PCR儀為德國艾本德股份公司生產(chǎn),真空冷凍干燥機為德國M ARTIN CHRIST生產(chǎn);紫外分光光度計為貝克曼公司生產(chǎn);恒溫搖床為美國Thermo公司生產(chǎn).引物由上海英駿生物技術有限公司合成生產(chǎn).

1.1.3 培養(yǎng)基

高氏1號培養(yǎng)基見參考文獻[6].斜面保存培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基和產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基均為高氏1號培養(yǎng)基.

1.2 方法

1.2.1 菌株初篩

直接從市售的甜酒釀中吸取100μL液體,均勻涂布于高氏1號培養(yǎng)基上.將一定量的酒曲與熟米飯相拌,暴露在空氣中2～3 d,選取所長的菌接種到培養(yǎng)基上.稱取酒曲10 g裝入小三角瓶中,加入90 m L無菌水,充分振蕩后靜置,取上清液做濃度梯度稀釋(0,10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8),用移液槍吸取稀釋液100μL并均勻涂布于高氏1號培養(yǎng)基表面.將接種的培養(yǎng)基于30℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3d后,從所長菌株中選出有明顯透明圈的菌株,劃線培養(yǎng)至純種,保種并編號.

1.2.2 淀粉酶活力測定0

采用改良的Yoo法[7],取5 m L 0.5%的可溶性淀粉溶液,在40℃水浴中預熱10 min,然后加0.5 m L粗酶液,反應10 min后用5 m L 0.1 mol/L H2SO4終止反應.取0.5 m L反應液與5 m L工作碘液顯色,在700 nm處測光密度.以0.5 m L滅活的粗酶液代替0.5 m L反應液為空白,以不加酶液(加相同滅活的粗酶液)為對照.

酶活力根據(jù)下式計算:酶活力(U/mL)=(R0-R)/R0×50×D.式中R0、R分別表示對照和反應液的光密度,D為酶的稀釋倍數(shù).調(diào)整D使(R0-R)/R0在0.2～0.7之間.

酶活力單位定義:在40℃10 min內(nèi)水解1 mg淀粉的酶量為一個活力單位.

1.2.3 菌株復篩

將初篩出來的幾株菌進行種子培養(yǎng),30℃,160 r/min,培養(yǎng)24 h.再以1%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基,30℃,160 r/min,培養(yǎng)24 h.將發(fā)酵液5000 r/min離心15 min,取上清液即為粗酶液.進行酶活力的測定后選出酶活力最強的一株菌作為下一步實驗的出發(fā)菌株.

1.2.4 菌落的形態(tài)特征觀察及生理生化性質(zhì)鑒定

觀察菌株在培養(yǎng)基上的菌落形態(tài),對細菌進行革蘭氏染色[6].細菌生理生化反應主要采用微量生化反應管,進行V.P.反應,檸檬酸鹽利用,H2S產(chǎn)生,明膠液化,乳糖、尿素、甘露醇、葡萄糖反應和穿刺接種,其方法參考《伯杰氏細菌鑒定手冊》[8]和《常見細菌鑒定手冊》[9].

1.2.5 菌株的16S rDNA序列測定

直接以菌液作為16S rDNA擴增的模板,所用引物為細菌通用引物,分別為上游引物Bac.27-F(5’-AGA GTTTGA TCCTGGCTCAG-3’)和下游引物Bac.1492-R(5’-GGTTACCTTACGACTT-3’). PCR的反應體系(25μL)為:15μL ddH2O,4μL dN TP,2.5μL 10×Buffer,1μL上游引物,1μL下游引物,1μL菌液,0.5μL Taq TM DNA聚合酶.PCR反應條件為:94℃預變性4 min,94℃變性30 s,55.4℃退火30 s,72℃延伸90 s,30個循環(huán);72℃延伸5 min,使產(chǎn)物完整.將PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測正確,割膠回收,送交上海英駿生物技術有限公司進行測序,將測定的DNA序列輸入GenBank,用BLASTN程序與數(shù)據(jù)庫中所有序列進行比較,分析該菌株的分類地位.

1.3 產(chǎn)酶條件優(yōu)化

1.3.1 產(chǎn)酶曲線與生長曲線的測定

采用分別裝有250 mL產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基的7個錐形瓶,對其中的6個錐形瓶進行接種,于30℃、160 r/min的搖床中培養(yǎng),每隔2 h測一次酶活.生長曲線(以未接種的培養(yǎng)基作對照)用比濁法進行測定,生長及酶活曲線的測定分別取三個平行實驗組.最后對生長曲線以菌濃度所對應的吸光度與時間關系作圖,酶活曲線則根據(jù)菌的酶活與時間關系作圖.

1.3.2 正交實驗

探討淀粉含量、KNO3含量、p H和溫度對菌株產(chǎn)酶的影響,以上清液酶活大小為指標,優(yōu)化產(chǎn)酶條件.正交實驗如表1、表2.

表1 正交因素表

表2 正交實驗表

2 結果與分析

2.1 產(chǎn)酶菌株的初篩

在平板篩選培養(yǎng)基上共篩選到3株具有淀粉酶活性的菌株,表明有產(chǎn)淀粉酶的特性.分別測量3株菌的透明圈直徑/菌落直徑比值,結果見表3.其中菌株編號為ZSY-II的比值較大,為9.453,ZSY-II的透明圈,如圖1.

表3 初篩結果

2.2 菌株復篩

將初篩有透明圈的3株菌作發(fā)酵培養(yǎng),經(jīng)改良的Yoo法進行酶活測定,結果表明,菌株ZSY-I、ZSY -II所對應的淀粉酶活力分別為5.98±1.39 U/m L、3.07±0.13 U/m L,ZSY-III的酶活幾乎為零,其中酶活力最高的為編號ZSY-I菌株,這與初篩結果不一致.

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 菌株形態(tài)觀察

菌株為革蘭氏陰性短桿菌,單個、成對或成短鏈排列,不運動.菌落為乳白色(時間長后顏色略微帶黃),半透明,呈近乎圓頂形且閃光,表面具有不同程度的粘稠度,水解圈明顯,如圖2.

2.3.2 菌株ZSY-I生理生化鑒定

菌株ZSY-I生理生化鑒定的結果見表4.

表4 菌株ZSY-I生理生化指標

表4 菌株ZSY-I生理生化指標

+.Positive;-.Negative

Gelatin liquefaction Mannite Glucose H2S Lactose Carbamide Indexes Gram reaction ZSY-I-+++-++ Indexes V.P.Citrate Mobility ZSY-I++-

2.3.3 菌株16S rDNA序列的擴增與分析

本實驗PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳結果如圖3.擴增產(chǎn)物測序結果經(jīng)核苷酸同源性比對后,表明該菌株與Klebsiella pneumoniae和Enterobacteriaceae bacterium的同源性高達99%.通過綜合菌株形態(tài)特征觀察和生理生化的鑒定,認為菌株ZSY-I屬于克雷伯氏菌屬.根據(jù)克雷伯式菌屬無產(chǎn)淀粉酶的描述,因此還需進一步確定其種,故目前初步將ZSY-I命名為Klebsiella sp.ZSY-I.

2.4 發(fā)酵條件的初步優(yōu)化

2.4.1 菌株生長曲線與相應時間產(chǎn)酶曲線

對生長曲線以菌濃度所對應的吸光度與時間關系作圖,結果見圖4.由圖4可知,3～30 h為菌的對數(shù)生長期,30～64 h為穩(wěn)定期.酶活曲線根據(jù)菌的酶活與時間的關系作圖,結果如圖4.由圖4可知,當?shù)竭_18～26 h時,酶活力為最大值,35 h后,酶活力開始下降.

2.4.2 正交實驗

發(fā)酵條件優(yōu)化中,通過正交分析得:在淀粉含量、溫度、p H、KNO3含量四個因素中,對菌株產(chǎn)酶影響較大的因素依次為KNO3、溫度、淀粉和p H.再經(jīng)極差分析得:淀粉2.5%、KNO31.25%、p H 7.5、30℃為發(fā)酵條件的最佳配合比.實驗結果如表5.

表5 正交分析表

3 討論

淀粉酶研究雖然起步較早,但到目前為止全世界有關的研究工作者仍沒有停止對其研究,并在此基礎上進一步研究開發(fā)新型淀粉酶[10～13].本研究分離得到的Klebsiella sp.ZSY-I菌株,在淀粉2.5%、KNO31.25%、p H 7.5、30℃的條件下培養(yǎng)24 h,達到最高酶活為14.66 U/m L,產(chǎn)酶能力一般.

在菌株的篩選中,最終分離到的菌株其透明圈直徑/菌落直徑的比值并非最大,一般認為直徑比與酶活呈現(xiàn)正相關性[7],但不能完全代表菌株的產(chǎn)酶能力,其原因有很多,比如:不同菌株具有不同的生長和產(chǎn)酶速度及不同酶系的淀粉酶;菌苔大小及在平板上堆積情況的差異等都會造成透明圈大小不同.這些可能是本文復篩與初篩結果不一致的原因所在.

近年來,細菌分類學家們廣泛采用16S rDNA序列分析法進行發(fā)育分類學研究[14].本實驗采用此方法將某一未知菌株的16S rDNA編碼序列與基因庫的16S rDNA序列進行同源性比較,結果顯示該菌株與Klebsiella pneumoniae和Enterobacteriaceae bacterium的同源性高達99%,但根據(jù)參考文獻[11]描述,Enterobacteriaceae bacterium為運動的周生鞭毛桿菌,而ZSY-I菌株無運動性且形態(tài)較小,這與Klebsiella pneumoniae相符,但不能確定其為Klebsiella pneumoniae,因為翻閱文獻沒有發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯氏菌有產(chǎn)淀粉酶的能力,故將ZSY-I分類為與Klebsiella pneumoniae同屬.

本研究成功地分離到一株產(chǎn)淀粉酶的Klebsiella sp.ZSY-I菌株,為今后的高產(chǎn)淀粉酶菌株的遺傳改良、基因工程菌的構建等工作奠定了基礎.

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Abstract:The aim of our study is to isolate a strain w ith amylase high p roducing capability and to op tim ize the fermentation conditions to increase enzyme p roduction.Samp les from sw eet fermented-rice and mold culture were used to screen amylase p roducing strains.The target strain was selected by comparing the haloes of colonies from starch p late and measuring enzyme activity.The strain was identified according to the morphology characterization,physiological and biochemical p roperties and 16S rDNA sequence analysis.An amylase high p roducing strain was screened and identified as Klebsiella sp.ZSYI.The culture conditions fo r enzyme p roduction w ere op tim ized through o rthogonal test.The facto rs affecting the enzyme p roduction was show n as KNO3(%)>Temperature(℃)>Starch(%)>p H.The maxim um amylase activity p roduced by ZSY-Iw as 14.66 U/m L on the culture medium containing starch 2.5%,KNO31.25%at 30℃and initial p H 7.5 for 24 h.

Key words:am ylase;Klebsiella sp.;isolation;identification;op timization

Isolation and Identification of a Klebsiella sp.Strain Produced Amylase and Optim ization of Conditions for Enzyme Production

YU Xiao-xia,SHEN Yan-xia,ZHANG Ling-long,Q IAN Kun,CA I Ke-jun
(Faculty of Life Science,Huzhou Teachers College,Huzhou 313000,China)

Q814.1

A

1009-1734(2010)02-0050-06

2010-01-10

俞曉霞,湖州師范學院生命科學學院2007級本科生,從事微生物研究.