三氯化鋁對小鼠認知功能的影響

袁晉峰,潘寶龍

近年來研究表明,一些神經(jīng)退行性疾病如透析性腦病綜合征、老年性癡呆(AD)、肌萎縮性側(cè)索硬化癥(AIS)等可能與鋁毒性有關(guān)[1]。鋁是一種對人體有害的元素,隨著鋁礦開采、煉鋁工業(yè)發(fā)展、鋁制品的制作加工使用、酸雨頻繁發(fā)生、食品添加劑的廣泛應(yīng)用等,鋁以各種形式通過呼吸道、消化道等多種途徑進入人體,鋁作業(yè)工人以及普通人群的機體內(nèi)鋁負荷越來越高。研究發(fā)現(xiàn),進入機體的鋁以Al(H2O)3+形式與轉(zhuǎn)鐵蛋白、白蛋白或枸櫞酸離子相結(jié)合,隨血液分布與腦、肝、腎、骨、肺等組織中,長期接觸鋁,可在腦組織中蓄積,干擾腦細胞活動,破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu),導致中樞神經(jīng)功能障礙[2,3]。因此,研究三氯化鋁(AlCl3)對認知功能的影響有理論和現(xiàn)實意義。

跳臺試驗、避暗試驗和水迷宮試驗是最常用的評價藥物對學習記憶的幾種動物模型[4]。記憶過程分為記憶獲得(acquisition)、鞏固(consolidation)和再現(xiàn)(retrieval),并且此 3個過程有先后次序,即首先是記憶獲得,然后鞏固,最后是再現(xiàn)[5]。根據(jù)記憶形成的特點,如果多次反復予以刺激往往會加強記憶[6,7]。在評價藥物對記憶鞏固影響的跳臺試驗、避暗試驗的模型中,根據(jù)記憶形成的特點,當小鼠被反復置于相同環(huán)境和接受多次電刺激時,無疑會加強記憶的鞏固。但如果小鼠出現(xiàn)相對于陰性對照組潛伏期縮短和錯誤次數(shù)增加,可以認為該藥物對小鼠記憶的鞏固有影響。同理,在水迷宮試驗中則表現(xiàn)為潛伏期的延長和穿越平臺次數(shù)減少。

本實驗通過跳臺試驗、避暗試驗和水迷宮試驗檢測小鼠的認知功能,探討三氯化鋁對小鼠認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 斷乳昆明種小白鼠(由山西醫(yī)科大學動物中心提供),雌雄各半。隨機分為對照組與低、中、高劑量組,每組8只。小鼠跳臺反射箱,小鼠避暗反射箱,Morris水迷宮(中國科學院藥物研究所研制)。

1.2 實驗方法

1.2.1 染毒方法 動物模型低劑量組、中劑量組、高劑量組分別飼喂含AlCl3飼料1.2mg/(kg?d)、12mg/(kg? d)、120 mg/(kg?d),對照組正常飼養(yǎng)。染毒9個月后,進行小鼠認知功能檢測。

1.2.2 認知功能檢測

1.2.2.1 小鼠跳臺試驗 將小鼠置于反射箱中適應(yīng)2 min,在底部銅柵通電的情況下,直接將動物置于平臺上,記錄小鼠被放上平臺到第一次跳下的時間,稱為LT,小鼠受電擊會逃避性跳上平臺,然后記錄 5 min內(nèi)小鼠跳下平臺次數(shù),即錯誤次數(shù)(EN),LT和EN共同作為記憶成績。

1.2.2.2 小鼠避暗試驗 反射箱分單獨5個箱,每個箱大小為36 cm×12 cm×12 cm。將小鼠放入反射箱中適應(yīng)2 min,24 h后在暗室銅柵通電的情況下,將小鼠置于明室,記錄小鼠從明室第一次進入暗室的時間,稱為潛伏期(LT),小鼠受電擊后會逃避性跑出暗室,然后記錄5 min內(nèi)錯誤次數(shù)(EN),LT和EN共同作為記憶成績。

2.2.3 Morris水迷宮試驗 迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機,計算機自動跟蹤計時并記錄游泳軌跡。定位航行試驗,試驗歷時5 d,每天訓練4次。4次潛伏期成績的平均值作為當日最終成績進入最后統(tǒng)計?？臻g探索試驗(Spatial probe test),第5天下午進行空間探索試驗,撤除平臺,將受試小鼠在西北象限池壁中點面向池壁放入水中,記錄60 s內(nèi)小鼠穿越平臺的次數(shù)作為小鼠的記憶成績。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠跳臺試驗檢測結(jié)果 與對照組相比,高、中劑量組小鼠跳臺試驗錯誤次數(shù)增多(P＜0.05),高、中劑量組與對照組相比潛伏期縮短,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 各鼠小鼠跳臺試驗結(jié)果(±s)

表1 各鼠小鼠跳臺試驗結(jié)果(±s)

組別 n 潛伏期(s) 錯誤數(shù)(次)對照組 8 141.50±68.67 0.43±0.65低劑量組 8 94.07±47.64 0.71±0.83中劑量組 8 47.31±15.881) 1.56±1.031)高劑量組 8 20.50±11.771) 1.93±1.071)與對照組比較,1)P＜0.05

2.2 小鼠避暗試驗檢測結(jié)果 與對照組相比,高、中劑量組小鼠避暗試驗錯誤次數(shù)增多(P＜0.05);高、中劑量組與對照組相比潛伏期縮短(P＜0.05)。詳見表2。

表2 各組小鼠避暗試驗結(jié)果(±s)

表2 各組小鼠避暗試驗結(jié)果(±s)

組別 n 潛伏期(s) 錯誤數(shù)(次)對照組 8 227.57±32.46 0.43±0.65低劑量組 8 199.57±39.63 0.57±0.85中劑量組 8 125.56±48.351) 1.31±1.011)高劑量組 8 81.36±37.191) 1.64±1.341)與對照組比較,1)P＜0.05

2.3 Morris水迷宮試驗 定位航行實驗,經(jīng)多組比較單因素方差分析,各組平均潛伏期差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與對照組相比,高劑量組平均潛伏期增加(P＜0.05)?？臻g搜索實驗,經(jīng)多組比較的單因素方差分析,各組穿越平臺的次數(shù)差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與對照組相比,中劑量組、高劑量組穿越平臺的次數(shù)與對照組相比明顯減少(P＜0.05)。詳見表3。

表3 小鼠Mo rris水迷宮潛伏期試驗結(jié)果(±s)

表3 小鼠Mo rris水迷宮潛伏期試驗結(jié)果(±s)

組別 n 水迷宮潛伏期(s)第1天 第2天 第3天 第4天 第5天穿越平臺次數(shù)次對照組 8 49.5±6.9 37.4±5.2 28.8±5.0 22.5±6.4 16.8±4.4 6.57±1.21低劑量組 8 52.9±6.5 43.7±5.6 32.5±6.6 25.2±5.9 21.6±5.7 5.00±0.63中劑量組 8 53.3±4.8 45.0±6.3 34.1±5.3 28.1±5.9 22.4±6.41) 3.50±0.541)高劑量組 8 58.0±3.51) 50.4±7.71) 43.0±6.31) 41.7±6.11) 39.8±5.91) 2.18±1.221)與對照組比較,1)P＜0.05

3 討 論

鋁化合物具有神經(jīng)毒性作用,可以誘發(fā)神經(jīng)變性,大量資料表明鋁可通過血腦屏障進入腦組織,導致學習記憶障礙,并與AD等神經(jīng)退行性疾病有關(guān),鋁可引起神經(jīng)細胞凋亡,鋁對學習記憶過程的細胞信使和信使分子有明顯影響,鋁直接損傷記憶的生理基礎(chǔ)——突觸可塑性[8]。鋁對組織器官的損傷作用在臨床上和動物實驗中都得到了廣泛證實[9-11]。Rankin等指出攝食過程中進行鋁暴露的大鼠其后代有行為上和神經(jīng)生化上的改變。流行病學研究顯示,環(huán)境鋁水平增高,特別是飲水中鋁濃度升高與認知損害和癡呆有一定關(guān)系[12-14]。據(jù)相關(guān)慢性動物實驗顯示,腦、脊髓等組織中鋁含量和鋁注射量呈正相關(guān),在腦毛細血管、內(nèi)皮細胞和腦組織中都有鋁的存在,以前頂皮質(zhì)、海馬和紋狀體最多。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),長期飲有高濃度的AlCl3溶液可使小鼠腦濕重明顯減輕,研究結(jié)果顯示,慢性鋁中毒使大鼠的空間分辨學習記憶能力和運動能力明顯降低。

鋁對學習記憶的抑制作用已在實驗和臨床上得到證實。但以往對鋁的神經(jīng)毒性研究多采取急性暴露或體外實驗方法,少數(shù)慢性毒性研究則常以腹腔注射或灌胃方式為主,與人體實際情況下經(jīng)水或食物的慢性攝鋁方式不符。本次研究以飼料中添加AlCl3的方式對斷乳小鼠進行染毒9個月后,對小鼠進行認知功能檢測。檢測跳臺試驗潛伏期和錯誤次數(shù)共同作為記憶成績。避暗試驗,潛伏期和錯誤次數(shù)共同作為記憶成績。水迷宮試驗:①定位航行試驗潛伏期;②空間探索試驗撤除平臺后,記錄60 s內(nèi)小鼠穿越平臺次數(shù)作為小鼠記憶成績。跳臺試驗、避暗試驗是根據(jù)記憶形成特點,將小鼠反復置于相同環(huán)境并接受多次電刺激,無疑會加強記憶的鞏固。實驗結(jié)果顯示,中劑量組和高劑量組相對于對照組潛伏期縮短且錯誤次數(shù)增加,可以認為三氯化鋁對小鼠記憶鞏固有影響。在水迷宮試驗中則表現(xiàn)為相對于對照組,中、高劑量組潛伏期延長和穿越平臺次數(shù)減少,高劑量組與對照組差異更加明顯。鋁可引起脂質(zhì)過氧化增強和自由基增多,可直接損傷各種酶類、載體、受體、通道和蛋白質(zhì),進而影響長時程增強(LTP)的形成和維持,影響學習記憶。本次研究結(jié)果顯示,慢性鋁中毒使小鼠的空間分辨學習記憶能力和運動能力明顯降低,和以往研究結(jié)果相符。

本次研究表明,三氯化鋁可引起小鼠認知功能障礙,攝入三氯化鋁量越大,對小鼠認知功能影響越大,可以推測三氯化鋁可以引起小鼠認知功能障礙,但其具體機制有待進一步研究。

[1]White,Longstrenth,Rrosentock,et al.Neurologic Syndrome in 25 works from an aluminum smelting plant[J].Arch Inten Med,1992:152-1443.

[2]Hollosi M,Urge L,Perczel A,et al.Metalion-induced conformation changes of phosphrylated fragments of human neurofilament protein[J].J Moliol,1992,223(6):673-682.

[3]Newman PE.Alzheimer's disease revisited[J].Med Hypotheses,2000,54(5):774-776.

[4]裴秋玲,現(xiàn)代毒理學基礎(chǔ)[M].北京:中國協(xié)和醫(yī)科大學出版社,2008:514-517.

[5]姚泰.生理學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2005:506-508.

[6]徐斌.生理心理學[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2006:121-123.

[7]周曉林,張進,戴體俊,等.東莨菪堿與氯胺酮合用對小鼠學習記憶的影響[J].徐州醫(yī)學院學報,2006,26(2):137-138.

[8]孫石磊,馬光瑜,徐小龍.納洛酮對鋁致學習記憶減退大鼠學習記憶的影響[J].中國行為醫(yī)學科學雜志,2003,12(6):607-608.

[9]He SC,Niu Q.Subclinical neurophysiological and autonomic nervous function.Effects of manganese in welding workers[J].Inter J Immunopathol Pharmacol,2002,15(2):23.

[10]黃國偉,康靜,張文治.鋁對體外人胚大腦神經(jīng)細胞毒作用的研究[J].中華預防醫(yī)學雜志,2000,34(2):106-110.

[11]Canales JJ,Corbalan R,Montoliu C,et al.Aluminum impairs the glutamate-nitric oxide-cGMP pathway in cultured neurons and in rat brain invivo:M olecular mechanisms and implications for neuropathology[J].Inorg Biochem,2001,(1-2):63-69.

[12]T imothy J,Shafer,Amy C,et al.Mechanisms underlying AlCl3inhibition of agonist-stimulated inositol phosphate accumulation:Role of calcium,G-proteins,phospholipase C and protein kinase C[J].Biochemical Pharmacology,1994,47(8):1417-1425.

[13]MonkameyerB,Michael S.Occupational aluminum exposure:Evidence in support of its neurobehavioral impact[J].Neuro Toxicology,2007,28(6)1068-1078.

[14]張兵.鋁的毒性[J].中國食品衛(wèi)生雜志,1998,10(4):31-34.