金頂側耳多糖提取工藝及其參數(shù)優(yōu)化

張婷婷，馬磊，邱凌

（1.西北農林科技大學林學院，陜西楊凌712100；2.西北農林科技大學農業(yè)部沼氣西北分中心，陜西楊凌712100；3.石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003）

金頂側耳多糖提取工藝及其參數(shù)優(yōu)化

張婷婷1,3，馬磊3，邱凌2,*

（1.西北農林科技大學林學院，陜西楊凌712100；2.西北農林科技大學農業(yè)部沼氣西北分中心，陜西楊凌712100；3.石河子大學生命科學學院，新疆石河子832003）

為提高金頂側耳多糖提取率、降低提取成本，分別采用單因素試驗和正交旋轉組合多因素試驗，對影響多糖堿提工藝的4個主要因素（溫度、時間、液固比和乙醇用量）進行分析，建立數(shù)學模型，并確定最優(yōu)工藝方案。二次回歸正交試驗結果表明，影響多糖提取率的主次因素順序依次為溫度、液固比、乙醇用量、提取時間。同時，溫度與時間、溫度與液固比的交互效應均極顯著（P<0.0001）。金頂側耳多糖各因素提取條件的最適范圍為乙醇用量為3.4倍～4.0倍，液固比為 38.3∶1～43.0∶1（mL/g），提取時間為 3.4 h～3.9 h 和溫度在 95.1 ℃～97.5℃。

金頂側耳；多糖；模型分析；優(yōu)化設計

Abstract：Using the single factor experiments and the orthogonal multi-factor experiments,we studied the influence of temperature,time,liquid-solid ratio and alcohol consumption on the polysaccharide extraction in Pleurotus Citrinopileatus.We then use a model to fit the relationship between these four factors and the extracted rate of polysaccharide.In the multi-factor test,temperature was the first greatest factor that influenced the extraction rate of polysaccharides,and liquid-solid ratio was the second one,and alcohol consumption the third one,and the extraction time was the weakest one.The interaction between temperature and time and the interaction between temperature and the liquid-solid ratio were significant（P<0.0001）.When the ethanol dosage within 3.4-4.0 times and the ratio of liquid to solid within 38.3∶1-43.0∶1 （mL/g）,the extraction time within 3.4 h-3.9 h and the temperature within 95.1℃-97.5℃,the polysaccharide extraction rate was the best.

Key words:Pleurotus citrinopileatus;polysaccharide;model analysis;optimize

金頂側耳（P.citrinopileatus）又名榆黃菇[1]。肉質鮮嫩美味，營養(yǎng)豐富。目前研究表明，金頂側耳子實體中分離出的多糖能夠清除超氧陰離子自由基，從而起到抗衰老的作用，并且具有增強人體免疫力和抗腫瘤、抗輻射、抗疲勞的功效[2]。從多糖的提取物中還可以分離得到降血酯活性成分洛伐他汀[3]。同時金頂側耳多糖對小鼠的體液免疫系統(tǒng)和細胞免疫功能均有明顯的增強作用[4]。

目前雖然食用菌多糖提取工藝研究報道較多，但對金頂側耳的相關文獻較少，并且普遍存在著低提取率，高成本的問題。如何提高多糖提取率是優(yōu)化工藝手段中的難題，如何使影響多糖提取率的各因素之間相互組合，相互作用，從而達到一種高提取率的平衡，是多糖提取研究領域中的難點[5]。溫度、時間、液固比和乙醇用量這些工藝參數(shù)的變化，都能夠直接影響到多糖提取率。本研究使用堿提金頂側耳子實體干粉的方法，分別采用單因素試驗和正交旋轉組合設計試驗，對影響多糖提取率的主要因素進行研究，建立提取工藝的數(shù)學模型，確定金頂側耳多糖提取的最佳參數(shù)，從而達到低耗能，高提取率的優(yōu)化目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金頂側耳、葡萄糖（105℃干燥至恒重）、重蒸酚、氫氧化鈉、95%乙醇、濃硫酸均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

多功能粉碎機、SK32004型超聲波儀：上?？茖x器公司；XW-80A漩渦混合器：江蘇海門市其林貝爾儀器公司；DKZ-2型電熱恒溫震蕩水槽：上海精宏試驗設備公司；減壓抽濾器、spectrumlab54紫外分光光度計：上海棱光技術有限公司；GL-20G-Ⅱ型高速冷凍離心機：上海安亭儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 含糖量標準曲線的測定

采用苯酚-硫酸法測定多糖含量。以葡萄糖含量（mg/mL）為橫坐標（x），490 nm波長下吸光值為縱坐標（y），繪制得到標準曲線y=0.152 x-0.007,R2=0.994。

1.3.2 多糖堿提試驗

將金頂側耳子實體在60℃下烘干后，粉碎過50目篩3次，稱取金頂側耳干粉2 g，分別加入不同體積的堿液中（pH=10）用超聲波儀處理15 min，使其充分混勻，堿液浸提[6]。樣品置于一定溫度時間下水浴后，進行減壓抽濾，保留濾液，棄濾渣。將濾液定容至100 mL，吸取該濾液2 mL，加入相應倍數(shù)體積95%乙醇，混勻，放置4℃冰箱醇沉24 h。20℃下6000 r/min離心10 min，棄上清液，用95%乙醇洗滌沉淀3次，加入重蒸水定容至10 mL，用漩渦混合器使沉淀充分溶解于重蒸水后，吸取該溶液0.5mL，進行含糖量的測定。

1.3.3 單因素試驗方案

將提取溫度、提取時間、浸提時液固比和醇沉的乙醇用量,分別設置 5 個水平:溫度為 60、70、80、90、100 ℃，提取時間為 1.5、2、2.5、3、3.5 h，液固比為 10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1，乙醇用量為堿液浸提后濾液的1、2、3、4、5 倍。在做各單因素試驗時，除自身的水平可以變化，其他3個因素均采用固定水平，即溫度80℃，提取時間2 h，液固比20∶1，乙醇用量2倍。每組試驗重復4次，取其平均值，依據(jù)含糖量標準曲線，計算多糖得率。

1.3.4 二次回歸正交旋轉組合試驗

單因素試驗結果為多因素試驗的設計提供了因素水平取值范圍參考，采用四因子二次回歸正交旋轉組合進行設計多因素試驗組合[7]，運用Design-expert統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析。試驗因子乙醇用量、液固比、時間和溫度實際的值分別用大寫字母變量X1,X2，X3和X4表示，這4個因素對應的無量綱的規(guī)范變量，用小寫字母x1、x2、x3和x4表示。以0水平為中心，加減各因素的變化區(qū)間得到因素水平編碼和各變量的取值見表1，試驗方案見表2。

表1 多因素試驗組合因素水平編碼表Table 1 Factors and code levels of experiments

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

單因素試驗見圖1。

2.1.1 溫度對多糖提取的影響

從圖1-a可見，多糖得率隨著溫度的升高而升高。當溫度為60℃時，多糖得率僅為3.66%，隨著溫度上升至90℃時，多糖得率達到最高值5.84%。當溫度上升至100℃時，多糖得率降低至5.58%，這可能是由于過高的溫度導致了大分子的多糖鍵斷裂,而造成多糖的損失。在0.01顯著水平上90℃極顯著。所以90℃是較為理想的堿提溫度。

2.1.2 提取時間對多糖得率的影響

在圖1-b中，在堿提時間為1.5 h～2 h時，多糖提取率由5.13%上升至5.68%；而在2 h～3.5 h之內，多糖得率由5.68%上升至5.76%，僅增加了0.08%。但各組浸提時間在0.05顯著水平上無顯著性。因而綜合多糖提取率和耗能耗時等方面，較優(yōu)堿提時間為2.5h。

2.1.3 液固比對多糖得率的影響

在 0.01 顯著水平上 20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 與 10∶1相比極顯著，而前三者彼此之間無顯著性。從節(jié)約生產成本的角度考慮，20∶1為較佳液固比值。

2.1.4 醇沉作用對多糖得率的影響

在0.01顯著水平上2、3、4、5倍與1倍相比極顯著。從圖1-d可見,隨著乙醇體積的增大多糖得率逐漸升高，但當乙醇體積為5倍時，多糖得率卻降低至4.83%，這可能是由于過大體積倍數(shù)的乙醇導致了多糖再次溶解[8]。就生產投入成本而言，2倍乙醇用量較為理想。

2.2 二次回歸正交旋轉組合試驗

2.2.1 模型擬合

根據(jù)四因子二次回歸正交旋轉組合設計進行多因素組合試驗，見表2。

表2 試驗設計及結果Table 2 Design and results of experiments

本研究分別用線性、二次和三次模型擬合了試驗組合所得多糖提取率。由這3個模型的方差分析，發(fā)現(xiàn)線性模型和二次模型均達到較優(yōu)的擬合效果（P<0.0001），但是二次模型的F值（90.34）大于線性模型的F值（17.841），即二次模型比線性模型更顯著。從模型失擬檢驗分析發(fā)現(xiàn)二次模型（P=0.2279）和三次模型（P=0.219）均不顯著，但二次模型P值大于三次模型，即二次模型擬合損失小于三次模型，因此二次模型擬合程度優(yōu)于三次模型。R2值比較,發(fā)現(xiàn)用線性、二次和三次模型的回歸貢獻率分別為0.697、0.979和0.980，另一方面，二次模型的殘差平方和（2.243）小于三次模型殘差平方和（15.63），即二次模型的預測值更接近于真實值。因此通過上述3種回歸模型的綜合指標分析，本研究選用二次模型來擬合本試驗。

2.2.2 回歸方程的建立與檢驗

通過二次回歸模型的方差分析，發(fā)現(xiàn)乙醇用量、液固比、提取時間和溫度4個因素的一次項和二次項均達到極顯著（P<0.0001）,并且只有液固比和溫度的交互作用、時間與溫度的交互作用達到極顯著（P<0.0001）。由于設計具有正交性，各回歸系數(shù)之間無相關性，因此可直接剔除模型中的不顯著項建立回歸方程[7,9]。通過整理無量綱方程（1）得到實際值方程（2）：

2.2.3 主效應分析

由于采用正交設計，并且方程（1）各因素均經(jīng)無量綱線性編碼處理，所有回歸系數(shù)間都是不相關的，因此可以由回歸系數(shù)絕對值的大小來直接比較各因素的一次項對多糖提取率的影響，各因素影響程度從大到小的排序為溫度>液固比>乙醇用量>時間（0.93>0.44>0.43>0.3）。

2.2.4 因素間的交互效應

因素間的交互效應見圖2、圖3。

在提取多糖過程中，各因素之間并不是簡單的獨立存在形式，它們之間有共存性且相互影響。溫度與時間交互效應達到極顯著（P<0.0001），同時從圖2中，等高線呈橢圓型，直觀體現(xiàn)出二者交互效應顯著[10]。通過觀察等高線圖中發(fā)現(xiàn)，當乙醇用量固定為3倍，液固比固定為30∶1的條件下，當溫度為85℃，提取時間為2.6 h，多糖提取率達到5.292%。當溫度上升至90℃，提取時間降至2.2 h，多糖提取率同樣能夠達到5.292%。低溫長時和高溫短時效果相近，所以適當?shù)奶岣邷囟?，并且適當縮短提取時間，有利于提高多糖提取效率。

溫度與液固比交互效應也達到極顯著（P<0.0001），從圖3中亦能直觀的體現(xiàn)出二者顯著的交互效應。在提取時間固定為2.5 h，乙醇用量固定為3倍的條件下，當液固比為30∶1，溫度為84.7℃時，多糖提取率達到5.229%（圖3）。觀察發(fā)現(xiàn)適當升高溫度縮小液固比，或者適當降低溫度擴大液固比，均能達到同等水平的多糖提取率。溫度與時間交互作用的F值（72.902）高于溫度與液固比的F值（36.488），因此溫度與時間的交互效應最顯著。

由于溫度同時和時間，液固比存在著交互效應，因此，高溫、短時、低液固比的組合，或者低溫、長時、高液固比的組合，都能夠達到同等水平的多糖提取率。從生產實際出發(fā)，應該因地制宜，選用低成本高效率的工藝提取方案。

2.2.5 確定各因素水平的最優(yōu)范圍

用統(tǒng)計優(yōu)選方法[7]，每個因素取 5 個水平：±2，±1，0。按照得到的二次模型進行計算機編程，模擬實現(xiàn)625個全因子試驗方案，并進行尋優(yōu)。

統(tǒng)計優(yōu)選方法預測的提取率高于5.8%的方案共46個（表3），占全部方案的7.4%，進行頻數(shù)分布分析，發(fā)現(xiàn)乙醇用量為 3.4 倍～4.0 倍，液固比為 38.3∶1～43.0∶1（mL/g），提取時間為3.4h～3.9h和溫度在95.1℃～97.5℃時，多糖提取率有95%的可能性高于5.8%。

表3 統(tǒng)計優(yōu)選方法預測提取率大于5.8%的頻數(shù)分布Table 3 Frequency distribution of the extraction rate greater than 5.8%

3 結論

1）通過二次回歸正交旋轉組合建立回歸的方程，排列出了四因素之間主次關系的順序，依次為溫度>液固比>乙醇用量>時間。

2）在試驗范圍內，溫度和時間的交互效應以及溫度和液固比的交互效應均達到極顯著（P<0.0001）。因此，高溫、短時、低液固比的組合，或者低溫、長時、高液固比的組合，都能夠達到同等水平的多糖提取率。

3）金頂側耳多糖得率的最優(yōu)條件適用范圍為乙醇用量為 3.4 倍～4.0 倍，液固比為 38.3∶1～43.0∶1（mL/g），提取時間為3.4 h～3.9 h和溫度在95.1℃～97.5℃。

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Parameter Analysis and Optimization of Conditions for Polysaccharides Extracted from Pleurotus Citrinopileatus

ZHANG Ting-ting1,3，MA Lei3，QIU Ling2,*
（1.College of Forestry Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi,China；2.The Northwest Station of Biogas Products and Equipment Quality Test Center of the Ministry of Agriculture，Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi,China；3.College of Life Science，Shihezi University，Shihezi 832003，Xinjiang,China）

2010-04-13

國家科技支撐計劃項目（2007BAK31B01）

張婷婷（1984—）,女（漢），助教，在讀碩士,主要從事生物能源與環(huán)境工程的研究。

*通信作者