一株假單胞菌降解溶解有機氮條件探討

李軍沖，齊樹亭，石玉新，焦利衛(wèi)

（河北工業(yè)大學(xué)海水高效利用化工技術(shù)教育部工程研究中心，天津300130）

一株假單胞菌降解溶解有機氮條件探討

李軍沖，齊樹亭*，石玉新，焦利衛(wèi)

（河北工業(yè)大學(xué)海水高效利用化工技術(shù)教育部工程研究中心，天津300130）

從生長大量藻類的河水中富集氨化細菌，分離優(yōu)勢菌，鑒定為假單胞菌屬（Pseudomonas）菌株，正交試驗法確定溫度、菌液加入量、曝氣時間、pH四因素對假單胞菌溶解有機氮（DON）去除的影響，選用L9（34）正交試驗表，以相對空白試驗的氨氮增加量為測定指標(biāo)。結(jié)果表明：降解溶解有機氮最佳條件為菌液加入量為2%，溫度為28℃，每天曝氣時間為6 h，pH為7.0，DON降解率為90.6%。

溶解有機氮；假單胞菌；正交試驗；降解

Abstract：Screening ammonibacteria from the river with a large number of algae,a predominant bacteria strain was isolated from the ammonibacteria,the strain was identified as Pseudomonas.The effects of temperature,dosage of pseudomonas,aeration time and pH were studied by orthogonal experimental.Selection of L9（34）orthogonal test,the increasing Ammonia-nitrogen relative blank experent as the examination index.The results showed the optimal conditions of degradating DON were as follows:strain inoculating dosage of 2%,28℃,aerate 6 h each day,pH 7.0,degradation rate of DON reached 90.6%.

Key words:dissolved organic nitrogen（DON）;pseudomonas;orthogonal experiment;degrade

食品工業(yè)廢水中常含有大量蛋白質(zhì)、微生物菌體和氮的化合物，對環(huán)境的污染嚴(yán)重，尤其會造成水體的富營養(yǎng)化。釀造、發(fā)酵和糧食加工的行業(yè)，在生產(chǎn)過程中每天都產(chǎn)生大量的有機廢水。這些廢水大多含有高濃度有機氮，如啤酒、味精、淀粉或豆制品加工所產(chǎn)生的廢水中所含有的有機氮是水體富營養(yǎng)化的重要影響因素[1-4]。

采用物理法、化學(xué)法、生物法等[5-9]方法降解氨氮、亞硝酸氮等無機氮，已有過大量的研究，而目前主要缺陷是對有機氮參加的循環(huán)和反應(yīng)研究相對很少，對涉及到有機氮的反應(yīng)過程缺乏了解[10]。

氮元素循環(huán)及其環(huán)境生態(tài)效應(yīng)研究是長期以來研究的熱點領(lǐng)域[11-12]。與無機氮相比，水體中有機氮的研究目前還開展得較少，尤其是對于DON的研究，這是由于水體中的有機氮成分復(fù)雜，準(zhǔn)確測定有機氮濃度存在困難，目前還只能間接測定[13-14]。有研究表明：DON與無機氮一起參與到水體中最活躍的生物過程，被浮游植物吸收的無機氮有25%～41%以DON的形式釋放[10]。河流湖泊等天然水體中溶解有機氮是溶解性總氮的主要組成部分，百分比可達到60%～69%，能迅速被生物利用[15]，和水體內(nèi)初級生產(chǎn)力息息相關(guān)，含有DON廢水的排入，是造成水體富營養(yǎng)化的主要因素之一。試驗從河水中富集、分離、純化的氨化細菌，采用正交試驗測定降解水體DON的最佳控制條件。并通過空白對照試驗測定DON轉(zhuǎn)化成NH3-N的增加比例，確定DON降解程度。

1 材料與方法

1.1 氨化細菌菌源

天津市北運河采集水樣，用玻璃纖維濾膜過濾，聚乙烯瓶中儲存。

1.2 試劑

蛋白胨、氯化鈉、氯化鉀、硫酸鎂、硫酸亞鐵、瓊脂、烯丙基硫脲、龍膽紫染液、碘液、95%乙醇、二氯化汞、氫氧化鈉、碘化鉀、無氨水等均為分析純。

1.3 主要儀器與設(shè)備

SHA-B型恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；YXQG02型電熱式蒸汽消毒器：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；722型光柵分光光度計：上海精密科學(xué)儀器有限公司；SL-CJ-1N醫(yī)用型潔凈工作臺：哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司北京分公司；XSZ-4G生物顯微鏡：重慶光學(xué)儀器有限公司。

1.4 富集培養(yǎng)基

蛋白胨 5 g，NaCl 0.25 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蒸餾水 1 L，pH 7.2。

1.5 分離培養(yǎng)基

蛋白胨5g，NaCl0.125g，F(xiàn)eSO40.10g，K2HPO40.15g，MgSO4·7H2O 0.15 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 L，pH 7.2。

以10%河水接種于富集培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中28℃避光培養(yǎng)，4 d后再以10%培養(yǎng)得到的菌懸液接種到新的富集培養(yǎng)基中，菌液渾濁度明顯加大時，將菌液在固體平板培養(yǎng)基上劃線分離，將培養(yǎng)皿倒置于28℃恒溫箱中進行培養(yǎng)。對單菌落氨化細菌進行液體培養(yǎng)，用分光光度計在660 nm處每天測其吸光度，并用奈氏試劑檢驗培養(yǎng)液中NH3-N的產(chǎn)生情況，如呈現(xiàn)黃色，說明生成NH3-N，此種細菌可將DON轉(zhuǎn)化為NH3-N，可判斷為氨化細菌。

1.6 菌種鑒定

按照文獻[16-18]的方法對分離純化的細菌進行鑒定，經(jīng)鏡檢、革蘭氏染色及一系列生理生化試驗鑒定菌種。

1.7 DON降解正交試驗

通過對曝氣時間、溫度、菌懸液加入量、pH采用四因素三水平正交試驗確定降解DON的最佳條件，各因素水平見表1。

表1 正交試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal test

1.8 DON檢測方法

DON的檢測沒有直接方法，可采用總氮含量除去無機氮來表示[10]，而無機氮包含氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮等，測定過程繁瑣。氨化細菌去除DON原理是將有機氮轉(zhuǎn)化成氨氮，試驗用氨氮的生成來表示DON的降解，待測水體中加入烯丙基硫脲[19]抑制氨氮被氧化。氨氮檢測采用納氏試劑法。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種鑒定

從分離純化的菌株中選擇一株相對優(yōu)勢菌鑒定，革蘭氏染色為陰性，有極生鞭毛，接觸酶試驗顯陽性，氧化酶試驗顯陽性，能夠氧化葡萄糖，鑒定為假單胞菌，編號L125。經(jīng)納氏試劑定性檢測證明其有降解DON的作用。

分離的L125菌株在搖床中培養(yǎng)，第4天到第5天為對數(shù)增長期，第6天后菌液吸光度增長趨勢開始明顯放緩。

2.2 L125降解DON正交試驗結(jié)果

選取曝氣時間、溫度、菌液加入量、pH四因素，將L125菌株放入配制好的人工DON廢水，設(shè)置不加菌液的空白對照組，在4 d內(nèi)，各試驗組氨氮含量相對空白對照組的增加含量均達到最高值，試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗結(jié)果分析Table 2 Analysis of the orthogonal test data

2.3 極差分析

由表2極差分析得出，溫度為影響L125菌株降解水體溶解有機氮的關(guān)鍵因素，四因素主次順序為：溫度＞菌液加入量＞每天曝氣時間＞水體pH。采用L125假單胞菌降解水體有機氮最佳組合為A2B2C3D1，最佳條件為30℃，菌液加入量為2%，每天曝氣時間為6 h，pH為7.5，所用時間為5 d，和對照試驗相比較，氨氮最大增加量為122.69 mg/L。各因素效果圖見圖1。

由圖 1 看出，A3、B2、C3、D2分別為降解有機氮的最佳單因素，故以A3B2C3D2為試驗條件，重新測定氨氮增加量，4 d內(nèi)最高增加量為127.35 mg/L，相比較A2B2C3D1組合，氨氮生成率有所增加，對DON的降解效果變化和第5組相比較相差＜1%，可見最佳菌液用量2%～3%，pH在7.0～7.5之間，但差異并不明顯，且D1更為接近自然水體，因此確定A2B2C3D1為降解有機氮的最佳組合。

5 d內(nèi)L125假單胞菌可達到最佳降解DON效果，并且不會對水體中微生態(tài)環(huán)境造成破壞。正交試驗結(jié)束后，繼續(xù)向第5組試驗水體中加入氨化細菌培養(yǎng)液，每天持續(xù)測量水體中氨氮含量，新生成氨氮含量在總按氮含量中比例為9.4%。綜合考慮認(rèn)為L125假單胞菌在A2B2C3D1條件下5 d達到降解DON最佳效果，降解率為90.6%。

3 討論

食品加工過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、氨基酸、微生物菌體等形式中的DON，經(jīng)微生物的氨化作用，都轉(zhuǎn)化為NH3。既使許多毒性大的有機物得到降解，同時又對代謝積聚的毒物起遷移轉(zhuǎn)化作用，在有機氮水體治理中的脫氮是關(guān)鍵的一步，再通過亞硝化細菌、硝化細菌作用生成NO2-N和NO3-N，最后由反硝化細菌還原成N2。DON的降解使食品加工產(chǎn)生的廢水從根本上降低了氮元素的含量，從而減小對天然水體富營養(yǎng)化的影響。

采用靜態(tài)模擬試驗，屬非擾動層水體環(huán)境，主要利用有機質(zhì)、鐵錳氧化物和硫酸鹽作為能量和最終電子受體[20]，利于菌體的生長及DON的去除。正交試驗用假單胞菌株L125降解DON的數(shù)據(jù)結(jié)果說明了DON的降解受菌量和試驗溫度影響，與DON濃度無關(guān)，與文獻[21]的結(jié)論一致，但不同的是，DON的降解還會受到pH和溶解氧的顯著影響。DON降解效果與李輝[22]等的結(jié)論相比較降解率更高，可能的原因是試驗用水體中營養(yǎng)物質(zhì)差別較大，水體中各種微量元素充足，利于微生物的生長代謝。

[1]古文炳,陳俊剛,梅榮武.高濃度含氮味精廢水綜合治理技術(shù)[J].工業(yè)水處理,2009，29(2)：83-86

[2]金蓓,李琳,李冰,等.啤酒工業(yè)廢水處理的研究概況[J].食品科學(xué),2007，28(10)：569-572

[3]高鋒,孫潔心,張永忠.冷凍濃縮法處理大豆乳清廢水的研究初探[J].食品研究與開發(fā),2005，26(4)：25-27

[4]李燕,宋俊梅,曲靜然.豆制品廢水的處理及綜合利用[J].食品工業(yè)科技,2002，23(7)：70-72

[5]張道斌,呂玉娟,張暉.化學(xué)沉淀法去除垃圾滲濾液中氨氮的試驗研究[J].環(huán)境化學(xué),2007，26(1)：62-65

[6]周婷,袁世斌,張小平,等.溝渠式生物接觸氧化法對有機物和氨氮的去除研究[J].環(huán)境污染與防治，2008，30(6):41-44

[7]萬興,廖志民,萬金保.新型單級APO程序無回流復(fù)合膜生物反應(yīng)器處理氨氮廢水的試驗[J].環(huán)境工程,2007,25(5):10-13

[8]楊波,楊志恒,胡文容,等.亞硝化細菌處理氨氮廢水的研究[J].武漢理工大學(xué)學(xué)報,2007,29(3):63-66

[9]王昌祿,隋志文,武晉海,等.亞硝酸鹽降解菌的分離及其降解特性[J].中國釀造,2008(9):33-35

[10]吳豐昌,王立英,黎文,等.天然有機質(zhì)及其在地表中的應(yīng)用[J].湖泊科學(xué),2008，20(1):1-12

[11]Bronk DA.Dynamics of DON.In:Hansell DA,Carlson CA eds.Biogeochemistry of marine dissolved organic matter[J].San Diego:Academic Press,2002:153-249

[12]Lehmann MF,Bernasconi SM,McKenzie JA.Seasonal variation of the δ13C and δ15N of particulate and dissolved carbon and nitrogen in Lake Lugano:Constraints on biogeochemical cycling in a eutrophic lake[J].Limnologyand Oceanography,2004,49(2):415-429

[13]黎文,白英臣,王立英,等.淡水湖泊水體中溶解有機氮測定方法的對比[J].湖泊科學(xué),2006,18(1):63-68

[14]Sharp JH,Rinker KR,Savidge KB,et al.A preliminary methods comparison for measurement of dissolved organic nitrogen in seawater[J].Marine Chemistry,2002,78:171-184

[15]StepanauskasR,LeonardsonL,TranvikLJ.Bioavailabilityofwetlandderived DON to freshwater and marinebacterioplankton[J].Limnology and Oceanography,1999,44:1477-1485

[16]R.E.布坎南,N.E.基本斯,等.伯杰細菌鑒定手冊[M].8版.北京:科學(xué)出版社,1984:60-62

[17]馬放.污染控制微生物學(xué)實驗[M].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)出版社,2002：103-115

[18]中國科學(xué)院微生物研究所細菌分類組.一般細菌常用鑒定方法[M].北京:科學(xué)出版社,1978：46-48

[19]劉建廣,張曉健,王占生.BACF處理高氨氮進水的硝化與反硝化作用[J].環(huán)境科學(xué),2006,27(1):69-73

[20]吳怡,鄧天龍,廖夢霞,等.天然水體沉積物中有機氮的研究進展[J].廣東微量元素科學(xué),2006,13(11):7-13

[21]趙永志,潘麗華,古偉宏.江水中有機氮降解規(guī)律的動力學(xué)研究[J].高師理科學(xué)刊,1999,19(3):55-57

[22]李輝,徐新陽,李培軍,等.人工濕地中氨化細菌去除有機氮的效果[J].環(huán)境工程學(xué)報,2008,2(8):1044-1047

Research on Conditions of Degrading Dissolved Opganic Nitrogen by a Pesudomonas

LI Jun-chong,QI Shu-ting*,SHI Yu-xin,JIAO Li-wei
（Engineering Research Center of Seawater Utilization Technology，Ministry of Education，Hebei University of Technology，Tianjin 300130，China）

2009-11-06

國家“863”計劃項目（2002AA648010）

李軍沖(1983—)，男（漢），在讀碩士研究生，主要從事微生物環(huán)境治理研究。

*通訊作者