石榴皮中多酚類物質(zhì)的提取和組成分析

唐麗麗，劉鄰渭，孫麗芳，秦燕，李景景，李璇

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，陜西楊凌712100）

石榴皮中多酚類物質(zhì)的提取和組成分析

唐麗麗1,2，劉鄰渭1，*，孫麗芳1，秦燕1，李景景1，李璇1

（1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100；2.楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程系，陜西楊凌712100）

采用3種工藝條件提取6種石榴皮中的多酚類物質(zhì)，測定提取液中總多酚、總黃酮和單寧的含量，以期為石榴皮的功能成分提取和分析方法的優(yōu)化提供參考。結(jié)果顯示：3種提取方法對總多酚和總黃酮提取量影響的差異性不顯著，而對單寧提取量影響的差異極顯著，即70%丙酮、70%乙醇和20%乙醇提取的單寧得率依次增高；石榴皮品種間總多酚、總黃酮和單寧含量的差異都極顯著，不同的提取方法和石榴皮品種交互作用對總多酚、總黃酮和單寧的提取得率無顯著性影響；3種提取方法所得不同品種石榴皮的提取液中總多酚、總黃酮和單寧含量兩兩間呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。

石榴皮；多酚；黃酮;單寧

Abstract：The polyphenols were extracted with three methods from six pomegranate peels and the total polyphenol,total flavonoid and tannin of the extracts were detemined,in order to developing functional food and nutraceutical and optimizing analytical methods.The results showed that:The extraction method did not effected significantly on the extractive yield of total polyphenol and total flavonoid,but of tannin,to which the yields increased gradually with 70%acetone,70%ethanol and 20%ethanol as extactive solvent respectively.The compounds’contents of different peels were different high significantly.The mutual effect between extraction method and variety of peel was no significant impact on the extractive yield.There were significant （P<0.01）linear-correlations among the contents of the three compounds in anyone of the six peels,no matter which extractive method being used.

Key words:pomegranate peel;polyphenol;flavonoid;tannin

石榴（Punica granatum）屬于石榴科石榴屬落葉灌木或小喬木，主要分布在亞熱帶及溫帶地區(qū),是一種營養(yǎng)豐富的珍奇漿果。石榴是國內(nèi)重點(diǎn)發(fā)展的水果之一，陜西臨漁、山東棗莊、安徽懷遠(yuǎn)、四川會(huì)理、云南蒙自為我國五大產(chǎn)區(qū)。目前，除了加工石榴汁、石榴果醬、石榴酒等食品外，開發(fā)石榴皮保健品的研究十分火熱。因此，深入研究石榴皮生物活性物質(zhì)的類別，研究提取物中活性單體的抗氧化和抗誘變機(jī)制，以及研究加工、處理和代謝作用對石榴皮生物活性物質(zhì)的影響，已成為開發(fā)新型石榴保健品和藥品的關(guān)鍵課題。

石榴皮占石榴的20%～30%，是常用的中藥，其性味甘、酸、溫、澀而無毒，可以治療多種疾病。石榴皮主要成分有單寧、蠟、樹脂、甘露醇、糖、樹膠、菊粉、沒食子酸、蘋果酸、果膠、草酸鈣、生物堿以及異棚皮苷[1]。其中單寧具有收斂、止血、抗菌、抗炎、清除自由基、預(yù)防自由基所致的氧化損傷、降血脂作用，以及抑制纖維蛋白溶酶、透明質(zhì)酸酶、合環(huán)氧化酶等多種酶活性的作用[2-5]。

在國內(nèi)外關(guān)于石榴皮研究的基礎(chǔ)上，選擇了幾種主栽品種的石榴皮，采用文獻(xiàn)報(bào)道的石榴皮總多酚、總黃酮和單寧的最優(yōu)提取工藝，對6種石榴皮進(jìn)行了提取試驗(yàn)和得率的分析，比較不同品種石榴皮間總多酚物質(zhì)、黃酮類化合物和單寧的含量差異，同時(shí)研究了不同提取工藝和三類提取物得率之間的關(guān)系，以及石榴皮所含三類功能成分含量之間的相關(guān)性，以期為石榴皮的功能成分提取、開發(fā)利用、以及分析方法的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 石榴皮

將陜西臨潼產(chǎn)新鮮魯峪蛋、三白甜、凈皮甜、大紅酸石榴以及新疆和田產(chǎn)新鮮皮雅曼石榴洗凈，除去瓤、籽后于40℃恒溫烘干，得到5種干石榴皮，加上市售陜西臨潼產(chǎn)混合品種干石榴皮，共得6種石榴皮（分別記為A1、A2…A6）。分別粉碎后過40目篩，粉末貯于廣口瓶中避光備用。

1.1.2 試劑

沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、Folin-Ciocalteu試劑、7.5%Na2CO3溶液、無水乙醇、10%Al3（NO3）溶液、5%NaNO2溶液、1 mol/L 乙酸鋅溶液、氨水、EDTA·2Na、鉻黑T指示劑等皆為市售分析純試劑，并用蒸餾水或其他溶劑按要求配制。

1.1.3 主要儀器

JA2003電子天平：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；UV-1700型分光光度計(jì)：日本島津公司；SC-2546低速離心機(jī)：科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；DHG-9030A電熱恒溫干燥箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司：KQ-600DB型超聲波清洗器:昆山超聲儀器有限公司；R-210型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士Bü CHI公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 石榴皮提取物的制備

1）提取方法一（記為 B1）：參考賈冬英[6]等的提取工藝。簡言之，以體積分?jǐn)?shù)20%的乙醇為提取劑，料液比為1∶20，50℃下回流提取，一次回流提取時(shí)間為1 h。

2）提取方法二（記為 B2）：參考呂琴[7]和陳紅梅[8]等的提取工藝。簡言之，以體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇為提取劑，料液比為1∶20，80℃下回流提取，一次回流提取時(shí)間為3 h。

3）提取方法三（記為 B3）：參考任平[9]等的提取工藝。簡言之，以體積分?jǐn)?shù)70%的丙酮為提取劑，料液比為1∶20，60℃下回流提取，一次回流提取時(shí)間為3 h。

4）提取步驟：準(zhǔn)確秤取2.000 g石榴皮粉置于圓底燒瓶中，分別按提取方法一、二、三相應(yīng)條件進(jìn)行操作，回流提取均為3次，抽濾，合并濾液。每個(gè)處理做3次重復(fù)。

說明：通過預(yù)試驗(yàn)可知，按4）進(jìn)行3次回流提取后，分別測定每次提取液的總多酚、總黃酮和單寧含量。結(jié)果說明，第三次提取得率僅約為第一次提取得率的七分之一。因此，本研究將3次提取所得的總多酚、總黃酮和單寧近似看作為它們在樣品中的含量。

1.2.2 石榴皮中總多酚含量測定

1.2.2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

將0.11 g一水合沒食子酸加水溶解并定容到100 mL容量瓶中，得1000 mg/L一水合沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精確吸取此溶液 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水稀釋至刻度，此時(shí)溶液濃度分別為 0.0、10.0、20.0、30.0、40.0、50.0 mg/L。

分別吸取上述沒食子酸溶液1.0 mL于10 mL具塞試管中，以蒸餾水為空白對照，然后，依次加入Folin-Ciocalteu試劑（加水稀釋1倍后的）0.5 mL，搖勻，然后加入7.5%碳酸鈉溶液4 mL，蒸餾水定容至10 mL，充分混勻后在室溫下避光靜置30 min，于760 nm處測定樣品吸光值，重復(fù)2次，取平均值。

將平行測定結(jié)果的平均值進(jìn)行線性回歸，得沒食子酸含量（X）與吸光值（Y）之間的直線方程，見圖1。樣品中總酚含量以沒食子酸含量表示[10]。

1.2.2.2 石榴皮中總多酚含量的測定

將三次提取液合并后，用蒸餾水定容，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟進(jìn)行顯色后在760 nm下測定吸光度，再按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算定溶液中總多酚含量，最后換算成參試石榴皮總多酚含量。

1.2.3 石榴皮中總黃酮類物質(zhì)含量測定

1.2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作[11]

準(zhǔn)確稱取40℃烘干恒重的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.10 g，用95%的乙醇溶解后轉(zhuǎn)入50 mL容量瓶中，并定容，得蘆丁儲備液。取5 mL蘆丁儲備液移入50 mL容量瓶中并用40%乙醇稀釋定容，得蘆丁工作液。分別精確吸取 0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、4.5 mL 蘆丁工作液于 10 mL 具塞試管中，以40%乙醇為空白對照，分別加入5%亞硝酸鈉0.3 mL后放置6 min，再分別加入10%硝酸鋁0.3 mL，再放置6 min，隨后各試管加入4%氫氧化鈉溶液4 mL，最后用40%乙醇補(bǔ)充到10 mL，靜置15 min，于507 nm處測吸光值，重復(fù)2次，取平均值。

將平行測定結(jié)果的平均值進(jìn)行線性回歸，得蘆丁濃度（X）與吸光值（Y）之間的直線方程，見圖2。樣品中黃酮含量以蘆丁含量表示。

1.2.3.2 石榴皮中總黃酮含量的測定

將先后3次的提取液合并后加水定容，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制作步驟進(jìn)行顯色后在507 nm下測定吸光度，重復(fù)2次取平均值，再按照標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算定容液的總黃酮含量，最后換算成參試石榴皮總黃酮含量。

1.2.4 石榴皮中單寧類物質(zhì)含量測定

測定單寧采用絡(luò)合法[9]。具體方法如下：

將3次提取液合并后加水定容至200 mL，量取50 mL提取液液溫（20±1）℃移入500 mL燒杯中，加水至約 300 mL，置（30±2）℃水浴中預(yù)熱，精確量取1 mol/L乙酸鋅溶液20 mL，置于500 mL容量瓶中，加入14 mL氨水搖勻，使白色沉淀溶解，緩慢將預(yù)熱后的溶液移入容量瓶中，邊移入邊振蕩，移畢繼續(xù)振搖1 min后，置于原水浴保溫30 min并間歇振搖數(shù)次，待反應(yīng)完畢，加水定容，取適量定溶液于3000 r/min離心5 min，取上層清液再于3500 r/min離心10 min，精確量取20 mL上層清液轉(zhuǎn)于錐形瓶，加300 mL蒸餾水、25 mL氯化銨+氨水緩沖液（pH＝10）和1 mL鉻黑T指示劑溶液，以0.05 mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液滴定至溶液由酒紅色變?yōu)榘邓{(lán)色，并用空白校正，重復(fù)滴定兩次，滴定結(jié)果取平均值。按照1 mL乙酸鋅（1 mol/L）消耗單寧 0.1446 g計(jì)，石榴皮中單寧類物質(zhì)含量計(jì)算公式如下：

式中：CZn為醋酸鋅標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量濃度，（mol/L）；CEDTA為EDTA·2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液物質(zhì)的量濃度，（mol/L）；V為校正后的EDTA·2Na標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定消耗量，mL；G為石榴皮粉樣品的質(zhì)量，g；X為石榴皮粉樣品的含水量，%。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)

試驗(yàn)數(shù)據(jù)利用Excel 2003數(shù)據(jù)分析工具進(jìn)行處理。分別進(jìn)行雙因素有重復(fù)方差分析，并用新復(fù)極差法（SSR法）檢驗(yàn)各處理平均數(shù)之間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚類物質(zhì)含量測定結(jié)果

對6種不同石榴皮粉用以上3種方法進(jìn)行提取，測定提取液中的總多酚、總黃酮以及單寧的含量，結(jié)果見表1。

表1 3種方法提取不同品種石榴皮的多酚類物質(zhì)含量的測定結(jié)果（x±s）Table 1 The pomegranate peel polyphenols contents of different species extracted with different method mg/g

2.2 方差分析與多重比較

2.2.1 提取方法對石榴皮總多酚含量測定結(jié)果的影響

2.2.1.1 方差分析

對3種提取方法得到的6種石榴皮粉總多酚含量進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表2。從表中可以看出3種提取方法以及提取方法和石榴皮品種的交互作用對總多酚提取量影響的差異性不顯著，而不同的石榴皮品種間總多酚含量的差異性極顯著。

2.2.1.2 多重比較

用SSR法對6種石榴皮進(jìn)行總多酚含量平均數(shù)間的多重比較，結(jié)果見表3。

表2 石榴皮總多酚含量測定結(jié)果方差分析表Table 2 Variance analysis of total polyphenol content in pomegranate peels

表3 石榴皮品種間總多酚含量均數(shù)多重比較結(jié)果（SSR法）Table 3 The multiple comparisons of total polyphenol's average contents of different pomegranate peels（SSR）

表明在α=0.05和α=0.01水平下A2和A6差異不顯著，即三白甜與混合皮粉的總多酚均數(shù)差異不顯著，其余品種兩兩間總多酚含量差異都極顯著。

2.2.2 提取方法對石榴皮總黃酮含量測定結(jié)果的影響

2.2.2.1 方差分析

對3種提取方法得到的6種石榴皮總黃酮含量進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表4。

表4 石榴皮總黃酮含量測定結(jié)果的方差分析表Table 4 Variance analysis of total flavonoid content in pomegranate peels

與2.2.1中對總多酚的方差分析結(jié)果相似，3種提取方法以及提取方法和石榴皮品種的交互作用對總黃酮的提取量影響的差異性不顯著，而不同的石榴皮品種間總黃酮含量的差異性極顯著。

2.2.2.2 多重比較

用SSR法對不同石榴皮總黃酮含量平均數(shù)間進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表5。

表5 石榴皮品種間總黃酮含量均數(shù)多重比較結(jié)果（SSR法）Table 5 The multiple comparisons of total flavonoid's average contents of different pomegranate peels（SSR）

表明在 α=0.05 水平下，三白甜（A2）與混合皮（A6）差異不顯著，其余品種間總黃酮含量差異都顯著；在α=0.01水平下，凈皮甜（A4）和三白甜（A2）的總黃酮含量差異不顯著，同時(shí)三白甜（A2）、混合皮（A6）和大紅酸（A3）三者間的總黃酮含量差異也不顯著，其余品種兩兩間總黃酮含量均數(shù)差異極顯著。

2.2.3 提取方法對石榴皮單寧含量測定結(jié)果的影響

2.2.3.1 方差分析

對3種提取方法得到的6種石榴皮單寧含量進(jìn)行方差分析的結(jié)果見表6。

表6 石榴皮單寧含量測定結(jié)果方差分析表Table 6 Variance analysis of tannin contents in pomegranate peels

從表6中可以看出提取方法和石榴皮品種的交互作用對單寧的提取量影響差異性不顯著，而3種提取方法對于單寧的提取量影響的差異性以及不同的石榴皮品種間單寧含量的差異性極顯著。

2.2.3.2 多重比較

①品種間單寧含量的多重比較

用SSR法對不同品種間石榴皮單寧含量平均數(shù)進(jìn)行多重比較，結(jié)果見表7。

表明在 α=0.05和 α=0.01水平下，三白甜（A2）與凈皮甜（A4）單寧含量均數(shù)間差異不顯著，其余品種兩兩均數(shù)間差異都極顯著。

②不同提取方法所得單寧提取量間的多重比較

對不同提取方法所得單寧提取量平均數(shù)間進(jìn)行多重比較的結(jié)果見表8。

表7 石榴皮間單寧含量均數(shù)多重比較結(jié)果（SSR法）Table 7 The multiple comparisons of tannin's average contents of different pomegranate peels（SSR）

表8 提取方法間所得單寧提取量均數(shù)的多重比較結(jié)果（SSR法）Table 8 The multiple comparisons of tannin's average contents of different extraction methods（SSR）

表明提取方法B1與B3、B2與B3所得單寧提取量間的差異極顯著，提取方法B1與B2所得單寧提取量間的差異顯著。

2.3 石榴皮中不同類多酚化合物含量的相關(guān)性分析

分別對3種不同提取方法從6種石榴皮中得到的總多酚、總黃酮和單寧含量進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見表9。

表9 三種方法提取的總酚、總黃酮和單寧含量間的相關(guān)系數(shù)Table 9 The correlation coefficients between total polyphenol,total flavonoid and tannin contents based on three methods

表中相關(guān)系數(shù)表明，不論采用哪種提取方法，從任何一種石榴皮得到的總多酚、總黃酮和單寧含量兩兩之間的相關(guān)性極顯著（P<0.01）。

3 結(jié)論

1）3種提取方法對總多酚、總黃酮提取量的影響差異不顯著，而對于單寧提取量的影響差異極顯著，單寧提取溶劑的優(yōu)劣順序?yàn)椋?0%乙醇優(yōu)于70%乙醇優(yōu)于70%丙酮；石榴皮品種間總多酚、總黃酮和單寧的含量差異極顯著，6種石榴皮總多酚和總黃酮的含量次序?yàn)椋呼斢?凈皮甜>三白甜>混合皮>大紅酸>皮雅曼，單寧的含量次序?yàn)椋呼斢?三白甜>凈皮甜>混合皮>大紅酸>皮雅曼；不同的提取方法和石榴皮品種的交互作用對總多酚、總黃酮和單寧的提取量差異性不顯著。

2）三種提取方法所得不同品種石榴皮提取液中的總多酚、總黃酮和單寧含量兩兩間呈極顯著的正相關(guān)關(guān)系（P<0.01）。

4 討論

1）從研究結(jié)果可知，無論采用那種提取方法，如果采用3次較長時(shí)間的提取，石榴皮中總多酚和總黃酮的提取均可達(dá)到較為完全，因此提取方法對于總多酚和總黃酮的提取效果影響無顯著差異；不同提取方法對單寧的提取量卻有顯著影響，其中提取方法1（B1）提取單寧的效果最好。在不同提取劑對單寧的提取效果方面，本文的試驗(yàn)結(jié)果和任平等[9]的研究結(jié)果不同，這是因?yàn)?，在比較不同提取劑的提取效果時(shí)，本研究采用的提取次數(shù)均為3次，每次都用了足夠長的時(shí)間，而其他人采用的提取次數(shù)僅為一次，每次所用的時(shí)間并未報(bào)道，所以，應(yīng)該說本文和他人所得的結(jié)果分別反映了不同提取劑對單寧提取效果影響的不同方面。

2）通過相關(guān)性分析可知，同一種方法從石榴皮中提取的總多酚、總黃酮和單寧的含量分析結(jié)果間始終存在著高度相關(guān)性。所以，在石榴皮多酚類物質(zhì)提取工作中進(jìn)行提取結(jié)果的測定時(shí)，可以選擇其中一類最易測定的多酚化合物進(jìn)行跟蹤測定，而其他兩類多酚化合物的含量可以憑借這種高度相關(guān)性進(jìn)行估測。這種高度的相關(guān)性未見前人報(bào)道，因此本結(jié)果的發(fā)現(xiàn)應(yīng)對減輕測定工作量具有較高參考價(jià)值。

3）不同石榴皮品種間的各類多酚物質(zhì)的含量間具有顯著差異，這一結(jié)果未見前人報(bào)道。因此，這一發(fā)現(xiàn)提示在開發(fā)石榴皮保健食品的過程中應(yīng)當(dāng)注重石榴皮品種的選擇。

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Pomegranate Peel Polyphenols Extraction and Analysis

TANG Li-li1,2,LIU Lin-wei1,*,SUN Li-fang1,QIN Yan1,LI Jing-jing1，LI Xuan1
（1.College of Food Science and Engineering，Northwest A＆F University，Yangling 712100，Shaanxi，China；2.Yangling Vocational＆ Technical College，Yangling 712100，Shaanxi，China）

2009-11-16

唐麗麗（1982—），女（漢），助教，碩士研究生，研究方向：食品化學(xué)。

*通訊作者：劉鄰渭，教授，博士生導(dǎo)師。