果蔬食品體外抗氧化方法研究進展

徐貴華，張鳳梅，張磊

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院外語系河南新鄉(xiāng)453003）

果蔬食品體外抗氧化方法研究進展

徐貴華1，張鳳梅2，張磊1

（1.河南科技學(xué)院食品學(xué)院河南新鄉(xiāng)453003；2.河南科技學(xué)院外語系河南新鄉(xiāng)453003）

食用果蔬食品可以有效降低多種疾病的發(fā)生率，抗氧化能力是重要原因。抗氧化物質(zhì)清除自由基的機制主要有氫原子轉(zhuǎn)移（HAT）和單電子轉(zhuǎn)移（SET）2種。本文具體介紹了ORAC法、TRAP法、PCL化學(xué)發(fā)光法、β-胡蘿卜素亞油酸體系、LDL低密度脂蛋白氧化方法、福林酚法、ABTS清除自由法、DPPH清除自由基法、FRAP法。并結(jié)合實例介紹果蔬食品體外抗氧化方法研究進展，對抗氧化方法的標(biāo)準(zhǔn)化進行了展望。

果蔬食品；抗氧化；氫原子轉(zhuǎn)移；單電子轉(zhuǎn)移

Abstract:Consumption of fruits and vegetables has been related with a lowered incidence of degenerative diseases.The positive influence of such diet is attributed to antioxidant capacity in them.Antioxidants can deactivate radicals by two major mechanisms,hydrogen atom transfer（HAT）and single electron transfer（SET）.Nine frequently used methods were introduced,namely：ORAC （oxygen radical absorbance capacity）,TRAP（total radical-trapping antioxidant parameter）,PCL（photochemiluminescence）,β-carotene bleaching method,low-density lipoprotein（LDL）oxidation,Folin-Ciocalte Assay,ABTS（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate））,DPPH（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）and FRAP（ferric reducing antioxidant power）.The recent development of antioxidant assays in vitro of vegetables and fruits were presented with instances,and the prospect of standardizing the antioxidant methods was made.

Key words：fruits and vegetables；antioxidant；hydrogen atom transfer；single electron transfer

越來越多的證據(jù)顯示食用水果蔬菜可以有效降低多種疾病的發(fā)生率，如心血管疾病、癌癥、免疫力下降等[1-2]。果蔬食品的上述功能主要歸因于其富含的多種維生素如VC、VE、胡蘿卜素、酚類物質(zhì)等。這些天然產(chǎn)物具備自由基清除能力，從而避免了生物細胞受到氧化損傷[3]。果蔬食品體外抗氧化研究成為國際上研究的熱點之一，基于不同的機理出現(xiàn)了眾多的抗氧化方法，國內(nèi)對果蔬食品抗氧化功能研究也方興未艾，本文主要就國外常用抗氧化方法做一定綜述。

1 果蔬食品體外抗氧化方法分類

目前用于體外測定果蔬食品抗氧化能力的方法從測定手段來劃分有：比色法、化學(xué)發(fā)光法、熒光法、電子自旋共振法（ESR）等。按抗氧化反應(yīng)機理可劃分為：氫原子轉(zhuǎn)移（HAT：Hydrogen Atom Transfer）和單電子轉(zhuǎn)移（SET：Single Electron Transfer）。常用抗氧化方法主要有以下幾種：ORAC（oxygen radical absorbance capacity）氧自由基吸收能力、TRAP（total radical-trapping antioxidant parameter）法、PCL（photochemiluminescence）化學(xué)發(fā)光法、β-carotene bleaching method（β-胡蘿卜素亞油酸體系）、low-density lipoprotein（LDL）oxidation（低密度脂蛋白氧化反應(yīng)）、Folin-Ciocalte Assay（福林酚法）、ABTS（2,2’-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonate）） 法、DPPH （2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl radical）法 、FRAP（ferric reducing antioxidant power）法等?？寡趸芰娙醯谋磉_方式主要有TEAC（Trolox equivalent antioxidant capacity）、抑制率、IC50（半抑制濃度）、AE（抗氧化效率）等，目前尚沒有標(biāo)準(zhǔn)化的食品體外抗氧化方法[4-5]。不同的抗氧化方法基于不同的反應(yīng)機理取得的結(jié)果總是不盡相同的，所以有必要采取多種抗氧化方法來評價抗氧化能力，以期獲得較客觀的抗氧化能力評價，本文結(jié)合實例介紹了國外近年來抗氧化方法研究進展。

2 常用果蔬食品體外抗氧化方法機理及應(yīng)用

抗氧化劑清除自由基的機制主要有HAT和SET 2種。雖然機制不同，但結(jié)果是一樣的。HAT反映的是抗氧化劑以供氫的方式清除自由基的能力：X·+AH→XH+A·。SET反映的是抗氧化劑以轉(zhuǎn)移電子來清除某種物質(zhì)的能力：包括金屬、自由基等：X·+AH→X-+A·+；M（III）+AH→AH++M（II）。

2.1 基于HAT反應(yīng)機制的抗氧化試驗方法

2.1.1 ORAC法

ORAC法最先由Ghiselli提出[6]，ORAC測定的是由氫過氧自由基所引發(fā)的氧化反應(yīng)。在ORAC體系中，過氧化氫自由基與熒光物質(zhì)反應(yīng)生成非熒光產(chǎn)物，通過記錄熒光值的減少來計算抗氧化物質(zhì)對自由基的抑制能力。通常使用熒光蛋白B-phycoerythrin(B-PE)、fluorescein或dichlorofluorescein作為熒光探針（fluorescent probe）。

應(yīng)用舉例[7]：以 Trolox（6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid，水溶性維生素E）為標(biāo)樣，在37℃，pH 7.4條件下與熒光物質(zhì)B-PE混和，加入氧化劑 AAPH （2，2’－azobis（2－amidinopropane）HCl），設(shè)置分析儀開始記錄熒光值（激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長525 nm），每分鐘記錄1次，共測35 min。隨反應(yīng)的進行B-PE減少而熒光減弱，熒光物質(zhì)測定值以初始值的相對值表示，結(jié)果用樣品熒光面積減去空白（未加抗氧化物質(zhì)）熒光面積的凈面積來表示，如圖1所示。用Trolox作標(biāo)準(zhǔn)曲線，μmTrolox/g當(dāng)量來表示抗氧化能力。

特點：ORAC法模擬了抗氧化劑清除食品體系中油脂氧化產(chǎn)生自由基的過程，可適用于親水與疏水抗氧化體系。ORAC法可以設(shè)計為自動完成，但反應(yīng)對溫度敏感，試驗過程中應(yīng)嚴(yán)格控制溫度。ORAC法不足之處是分析時間較長。在國外ORAC法是一種較為公認的抗氧化方法，許多不同果蔬產(chǎn)品間的抗氧化能力比較就是采用的這種方法，目前國內(nèi)少有采用ORAC法的報導(dǎo)。

2.1.2 TRAP法

與ORAC法類似的反應(yīng)機理，TRAP法采用R-phycoerthrin作為熒光探針。用氧化劑AAPH或ABAP[2,2-azobis（2－amidinopropane）dihydrochloride]產(chǎn)生氫過氧自由基。在抗氧化物質(zhì)加入后，熒光值的減弱將延遲，以延遲時間與加入Trolox（標(biāo)樣）量作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖2。

應(yīng)用舉例[8]：1.5×10-8mol/LR-PE 溶于 75 mmol/L pH 7.0的磷酸緩沖液，加入待測樣品使終體積為2 mL,37℃下于1 cm的石英熒光比色皿放置5 min，加入ABAP（使終濃度為4 mmol/L）引發(fā)氧化反應(yīng)，測定RPE熒光的減少，每5 min測一次，至90 min，激發(fā)波長495 nm,發(fā)射波長575 nm，以Trolox為標(biāo)樣作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

特點：TRAP法最常用于體內(nèi)血清與血漿抗氧化能力的測定，因為它測定的是非酶抗氧化物質(zhì)，如抗壞血酸、生育酚、β-胡蘿卜素、谷胱甘肽等。缺點是重復(fù)性差、費時、操作復(fù)雜。

2.1.3 PCL化學(xué)發(fā)光法

通常采用既是發(fā)光劑又是自由基檢測劑的luminol來檢測自由基，國外已有商品化的PCL試劑盒。反應(yīng)體系產(chǎn)生的超氧自由基與luminol反應(yīng)而發(fā)光，用微弱發(fā)光儀計錄發(fā)光值，在抗氧化物質(zhì)存在下發(fā)光時間會延遲，從而可建立標(biāo)樣（如抗壞血酸）與發(fā)光延遲時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過測定樣品使發(fā)光延遲的時間而計算出其抗壞血酸當(dāng)量。

應(yīng)用舉例[9]：采用Photochem公司（德國柏林）的試劑盒，1.5 mL的試劑1（樣品溶劑），1.5 mL的試劑2（反應(yīng)緩沖液），25 μL 稀釋的試劑 3（luminol），10 μL 試劑4（抗壞血酸）或樣品溶液。以發(fā)光延遲時間（秒）和抗壞血酸濃度(0.05 mmol/L~0.3 mmol/L)為坐標(biāo)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，以樣品延遲發(fā)光時間計算出抗壞血酸當(dāng)量。

特點：可以有效測定抗氧化劑清除超氧自由基的能力，可用于親水和疏水條件，但每次只能測一個樣品。有試驗表明，PCL的測定結(jié)果與ORAC測定結(jié)果的相關(guān)性很小，可能是因為它們反映的是抗氧化物質(zhì)對完全不同來源的自由基清除能力。

2.1.4 β-胡蘿卜素亞油酸體系

基于乳化體系中亞油酸自氧化產(chǎn)生自由基而使體系中的β-胡蘿卜素褪色，在抗氧化物質(zhì)存在下可延遲褪色。記錄體系隨時間而變化的吸光值，用抑制率來表示抗氧化能力。

應(yīng)用舉例[10]：2 mg β胡蘿卜素溶于10 mL氯仿，取1 mL β-胡蘿卜素溶液與20 mg純化的亞油酸及200 mg吐溫40混和，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去氯仿。加入50 mL蒸餾水超聲混和均勻，樣品（2 mg/mL）或?qū)φ湛寡趸瘎˙HA、BHT等）加入到5 mL β胡蘿卜素/亞油酸體系中，空白用0.2 mL水和5 mL β胡蘿卜素/亞油酸乳化液。樣品加入后，立即在470 nm下記錄吸光值，密封比色管，并置于50℃水浴中，每15 min測一次吸光值至120 min，另一份乳化液不加β胡蘿卜素，其余操作同上，用于分光光度計調(diào)零，測定結(jié)果如圖3所示。

特點：屬于直接抗氧化方法，以亞油酸自氧化模擬生物體內(nèi)自由基的產(chǎn)生，區(qū)別于DPPH、ABTS等非天然的大分子自由基。但只能用抑制率一種方式來表達抗氧化能力，且試驗可重復(fù)性較差。

2.1.5 LDL氧化法

從新鮮血樣中分離LDL，用Cu2+或AAPH引發(fā)氧化反應(yīng)，隨后在234 nm下測定共軛二烯(conjugated dienes)或測定油脂過氧化物含量。

應(yīng)用舉例[11]：采集新鮮血樣于試管，加入抗凝結(jié)劑，40°C超離心分離LDL，然后將LDL溶于0.4 mL pH 7.4的PBS緩沖液，使最終濃度為100 μg/mL，用10 μmol/L的AAPH或Cu2+引發(fā)氧化反應(yīng)，加入5 μL的甲醇提取物。LDL樣品在37°C培養(yǎng)箱下放置60 min，用1 mmol/L EDTA和10 μmol/L的BHT結(jié)束反應(yīng)，加入內(nèi)標(biāo)（1 nmoL共軛二烯脂肪酸酯），然后與500 μL乙醇混和，用2 mL正己烷提取，收集正己烷相，揮發(fā)至干后溶于100 μL異丙醇，HPLC測定膽固醇亞油酸過氧化物（chol-18∶2-OOH）。HPLC 條件：C18反相柱，測定波長234 nm，流動相為50%異丙酮、40%乙腈和溶有0.1%乙酸銨的10%甲醇，流速1 mL/min。內(nèi)標(biāo)通過共軛二烯亞油酸與飽和脂肪酸（C20∶0） 反應(yīng)來制備，Chol-18∶2-OOH 的制備是由 1 mg膽固醇亞油酸酯/mL(溶于正己烷)在37°C條件下密封放置48 h自動氧化來完成。

特點：試驗顯示采用AAPH作氧化劑的LDL氧化法與ORAC法有良好相關(guān)性，而采用Cu2+卻沒有。LDL法一個重要不足是它必須從不同個體獲得血樣，從而難以成為可重復(fù)的抗氧化方法。

2.2 基于SET反應(yīng)機制的抗氧化實驗方法

2.2.1 福林酚法

福林酚法最早用于測定蛋白質(zhì)中色氨酸（含有一個酚羥基）含量，后來廣泛用于測定總酚含量，本質(zhì)上是氧化還原反應(yīng)。

應(yīng)用舉例[12]：1 mL適當(dāng)稀釋的樣品或綠原酸標(biāo)樣加入到裝有9 mL蒸餾水的25 mL比色管，加入1 mL福林酚試劑混和均勻，5 min后，加入10 mL 7%Na2CO3后立即加蒸餾水稀釋至25 mL并混勻，23°C下放置90 min，然后750 nm下測定吸光值，總酚含量以綠原酸當(dāng)量表示(mg/100 g)。

特點：對植物來源樣品總酚的測定簡單而有效，但容易受到糖、VC、有機酸等物質(zhì)的干擾，與ORAC、ABTS、DPPH等其它抗氧化方法測定結(jié)果通常有較好的相關(guān)性。

2.2.2 ABTS法

ABTS（分子結(jié)構(gòu)如圖4所示），產(chǎn)生ABTS+的方法有多種，一種較常用且簡單的方法是：用氧化劑AAPH或過硫酸鉀氧化ABTS成藍綠色的自由基形式ABTS+，通過測定抗氧化物質(zhì)與ABTS+反應(yīng)而顏色變淺反映清除自由基能力，以TEAC表示抗氧化能力。

應(yīng)用舉例[13]：ABTS（7 mmol/L）與過硫酸鉀（最終濃度：2.42 mmol/L）混和室溫避光放置 12 h～16 h，以產(chǎn)生藍綠色的ABTS·+。試驗前，用乙醇將ABTS+溶液稀釋至734 nm 下吸光值 0.70（±0.02），100 μL 樣品與 1 mL ABTS·+混和30 s后放置6 min，然后測定吸光值，以Trolox（20 μmol/L～200 μmol/L）建標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品抗氧化能力以TEAC表示。

特點：簡單快速、pH適用范圍寬、可用于親水和疏水體系，并能實現(xiàn)自動化完成。但ABTS陽離子自由基并非生物體所產(chǎn)生，而且不能反映不同抗氧化物質(zhì)反應(yīng)速度的差異，在設(shè)定的時間內(nèi)反應(yīng)可能并未完成，對測定結(jié)果造成較大誤差。

2.2.3 DPPH法

DPPH（分子結(jié)構(gòu)如圖5所示）是一種穩(wěn)定的深紫色自由基，不必象ABTS+需要事先反應(yīng)產(chǎn)生。通過測定抗氧化物質(zhì)與DPPH反應(yīng)而顏色變淺來反映清除自由基能力，常以半抑制濃度（EC50）或TEAC表示抗氧化能力。

應(yīng)用舉例[14]：取50 μL提取液與5 mL 0.1mmol/L DPPH甲醇溶液混合振蕩，于27°C放置20 min，不加提取液作空白，甲醇試劑用于調(diào)零，517 nm下測定吸光值（OD），以抑制率表達自由基清除能力。抑制率=[(空白 OD-樣品 OD)/空白 OD]×100%。

特點：簡單快速，但如果反應(yīng)體系中存在515 nm下有吸收的物質(zhì)（如胡蘿卜素），結(jié)果就會被干擾，另外不能反映不同抗氧化物質(zhì)反應(yīng)速度的差異。

2.2.4 FRAP法

FRAP最先用于測定血清的還原力，隨后用于植物來源抗氧化物質(zhì)的分析。它通過測定抗氧化物質(zhì)還原 Fe3+-TPTZ（2,4,6-trypyridyl-s-triazine）為 Fe2+-TPTZ（如圖6所示）的能力來反映抗氧化能力。

應(yīng)用舉例[9]：FRAP試劑制備：醋酸緩沖液（300 mmol/L,pH3.6），與溶于 40 mmol/L HCl的10 mmol/L TPTZ 和 20 mmol/L FeCl3以體積比 10∶1∶1混和。標(biāo)樣溶于水或甲醇，300 μLFRAP試劑與10 μL的標(biāo)樣或樣品混和均勻，立即在593 nm下測吸光值，每分鐘測1次至4 min，樣品FRAP值以抗壞血酸當(dāng)量計算。

特點：簡單快速，不需要特殊設(shè)備，可以設(shè)計為自動化完成。與DPPH和ABTS法類似，F(xiàn)RAP法也不能反映不同抗氧化物質(zhì)反應(yīng)速度的差異。

3 果蔬食品體外抗氧化方法比較及其標(biāo)準(zhǔn)化展望

基于ET反應(yīng)機制的福林酚法、DPPH法、ABTS法、FRAP法分析結(jié)果通常有良好的線性關(guān)系，因為它們都是基于類似的氧化還原反應(yīng)，所以同時使用多種ET反應(yīng)機制的抗氧化方法是沒有必要的。VE保護食品或細胞不飽和脂肪酸不被氧化的機制是HAT機制，氫過氧自由基（peroxyl radical）是食品與生物系統(tǒng)中脂肪氧化的重要因素，在ORAC等HAT反應(yīng)機制的分析中，研究抗氧化物質(zhì)抑制氫過氧自由基的過程，可以提供有用的自由基鏈反應(yīng)的信息。HAT反應(yīng)機制的ORAC、TRAP、β-胡蘿卜素亞油酸體系的分析方法是基于自由基鏈反應(yīng)的，因此更接近食品或生物體真實氧化情況，但它們試驗周期長，不適合于天然產(chǎn)物的批量測定。而基于ET反應(yīng)機制的分析方法如DPPH和ABTS等使用雖然簡單方便，但它們所提供的信息是天然產(chǎn)物對某種穩(wěn)定的大自由基如DPPH、ABTS的清除能力，而不能反映天然產(chǎn)物對氧化過程的抑制作用。另外它們同樣有重復(fù)性差的不足，主要原因是具體試驗條件的選擇不同造成的，如試劑濃度、反應(yīng)時間等，但這些可以通過方法的標(biāo)準(zhǔn)化來實現(xiàn)。事實上任何一種抗氧化方法都不能反映真正的抗氧化能力，所以在選擇試驗方案時，應(yīng)盡量選擇基于不同反應(yīng)機制的抗氧化方法，從而獲得天然產(chǎn)物較客觀的抗氧化能力評價。

目前，抗氧化方法仍未實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，不同實驗室的分析報告結(jié)果難以進行統(tǒng)一比較。最有可能實現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化的抗氧化方法是ORAC法、福林酚法和ABTS法[4]。屬HAT機制的ORAC法可以反映生物體相關(guān)抗氧化機理，屬SET機制的ABTS法可反映抗氧化物質(zhì)清除自由基的能力，而福林酚法是最簡單有效、省時省力，適用于大量分析樣品的方法。

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Development of Antioxidant Assays in Vitro of Fruits and Vegetables

XU Gui-hua1,ZHANG Feng-mei2,ZHANG Lei1
（1.Department of Food Science，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003,Henan,China;2.Department of Foreign Language，Henan Institute of Science and Technology，Xinxiang 453003，Henan,China）

2010-04-17

徐貴華（1977—），男（漢），講師，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學(xué)。