響應面分析法優(yōu)化女貞子水溶性多糖提取工藝

黃寶旭，劉軍海，張靜

（聊城大學化學化工學院，山東聊城，252059）

響應面分析法優(yōu)化女貞子水溶性多糖提取工藝

黃寶旭，劉軍海，張靜

（聊城大學化學化工學院，山東聊城，252059）

研究女貞子水溶性多糖的提取工藝。在單因素試驗基礎上選取試驗因素與水平，根據(jù)中心組合（Box-Benhnken）試驗設計原理采用三因素三水平的響應面分析法，依據(jù)回歸分析確定各工藝條件的影響因子，以女貞子水溶性多糖提取率為響應值作響應面和等高線。在分析各個因素的顯著性和交互作用后，得出女貞子水溶性多糖浸提的最佳工藝條件為：料水比1∶15（g/mL），浸提溫度94℃，浸提時間3 h；浸提2次，女貞子水溶性多糖的實際一次提取率可達5.260%。

女貞子；水溶性多糖；提??；響應面分析

Abstract:The extraction techniques of water-soluble polysaccharide from Fructus ligustri lucidi（WPFLL）were studied in this paper.On the basis of single factor experiments，the optimum conditions for the extraction of WPFLL were obtained through Box-Benhnken center-united experiment design and Response Surface Methodology.The results showed that the optimum conditions of WPFLL extraction were as follows：extraction temperature of 94 ℃,the ratio of material to water of 1∶15,and extraction time of 3 h，extraction twice.Under such condition the extraction rate could be up to 5.260%at one extraction.

Key words：Fructus ligustri lucidi;water-soluble Polysaccharide;Extraction;Response surface methodology

女貞子（Fructus ligustri lucidi）系木犀科植物女貞的成熟果實,女貞子多糖（polysaccharide from Fructus ligustri lucidi）為其有效成分,根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，肝腎不足可導致人體衰老，女貞子可防治因肝腎不足引起的頭暈耳鳴，雙目昏糊，腰膝酸軟，須發(fā)早白[1]?，F(xiàn)代研究表明，女貞子多糖具有抗氧化[1]、增強免疫[2-5]、抗衰老作用[6-7]。文獻報道，女貞子中的多糖主要由鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖及巖藻糖種糖組成,可以提高機體的非特異性免疫功能,對細胞的免疫效應有促進作用[8]。因此開發(fā)和利用女貞子多糖對制藥和保健品工業(yè)具有重要的意義。國內(nèi)眾多的研究集中在女貞子多糖的藥理生理功能以及化學成分方面[1-11]，對于女貞子多糖提取工藝的研究較少，尤其是利用響應面法對女貞子水溶性多糖提取工藝的優(yōu)化，未見文獻報道。

響應面法(RSM)由一組數(shù)學和統(tǒng)計學方法組成，可用于確定各因素及其交互作用在加工中非獨立變量的影響，可以精確地表述因素和響應值之間的關系，是一種優(yōu)化反應條件和加工工藝參數(shù)的有效方法，廣泛應用于化學化工、生物工程、食品工業(yè)等方面[12-13]。為此筆者在單因素實驗的基礎上，利用響應面分析法對女貞子水溶性水溶性多糖提取工藝條件進行了優(yōu)化，獲得最佳提取工藝條件，以期對女貞子的深加工和女貞子多糖產(chǎn)品的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

女貞子（江蘇產(chǎn)，購于聊城某藥店）、優(yōu)質工業(yè)酒精、苯酚（AR）、濃硫酸（AR）、蔗糖（AR）(以上試劑均購于天津化學試劑三廠)。

1.2 儀器

AR-1104電子天平：奧克斯國際貿(mào)易上海有限公司；DKB-501A型超級恒溫槽：上海精宏試驗設備有限公司；SHB-11循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；TU-1810紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限責任公司。

1.3 方法

1.3.1 水溶性水溶性多糖含量與提取率的測定

1.3.1.1 標準曲線的繪制[14]：

精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖36.50 mg，置100 mL容量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，配得葡萄糖標準溶液。精密吸取葡萄糖標準溶液0、0.1、0.2、0.4、0.6 mL，分別置于 10 mL 容量瓶中，分別加入蒸餾水補至2 mL，然后分別再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出置冷水中冷卻10 min，同時用2.0 mL蒸餾水做空白，用分光光度計在波長480 nm處測定吸光度，得標準曲線方程：C=17.9533A+2.1724，相關系數(shù)r=0.9950。

1.3.1.2 水溶性水溶性多糖含量與提取率的測定

水溶性水溶性多糖含量與提取率的測定采用苯酚－硫酸法[12-14]，精密吸取樣品溶液2 mL置于10 mL容量瓶中，并加水稀釋定容。然后精密量取0.5 mL，至于10 mL容量瓶中，加蒸餾水補至2 mL,然后再加入5%的苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入濃硫酸5.0 mL，搖勻后置40℃水浴中加熱15 min，取出置冷水中冷卻10 min，同時用2.0 mL蒸餾水做空白，用分光光度計在波長480 nm處測定吸光度。水溶性多糖提取率用式（1）計算：

1.3.2 提取方法

1.3.2.1 水溶性多糖提取工藝流程

女貞子→干燥→粉碎（過20目）→石油醚脫脂→90%濃度乙醇回流→濾渣→蒸餾水回流→抽濾得濾液→定容→測定水溶性多糖含量

1.3.2.2 提取方法

精確稱取女貞子粉末約5.0 g于250 mL圓底燒瓶中，加入30 mL石油醚，在80℃下回流1 h用于脫脂，抽濾得濾渣，在濾渣中再加入90%乙醇80 mL加熱回流1 h，過濾，濾渣用10 mL 90%乙醇洗滌兩次，以徹底除去單糖、低聚糖等成分。然后再向濾渣中加入一定量的蒸餾水，在一定溫度下回流一定時間，提取水溶性多糖，濾液于250 mL容量瓶中定容后，取2 mL試液定容在10 mL容量瓶中。精密移取0.5 mL按上述方法測定樣品吸光度，計算水溶性水溶性多糖含量。

2 結果與分析

2.1 提取時間對女貞子水溶性多糖提取率的影響

女貞子中含單糖、雙糖、低聚糖、醇溶性蛋白質等物質，由于水溶性多糖溶于水而不溶于高濃度乙醇，根據(jù)此原理先用90%的乙醇回流1 h，來除去單糖、低聚糖等對水溶性多糖提取率有影響的物質，然后用蒸餾水提取水溶性多糖。

固定溫度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分別回流1 h后，過濾去除液體，然后濾渣在80℃，固定料液比1∶20的情況下，分別回流提取0.5、1.2、3、4、5 h，試驗結果見圖 1。

由圖1中可看出，多糖提取率隨時間逐漸增大，當達到3 h提取率最大，而在提取4 h、5 h變化不大，基本趨于平緩。同時從提取的多糖溶液可以看出，隨著時間的增加，多糖顏色加深。提取時間越長越有利于多糖的提取。但加熱時間若過長，能耗明顯要增加，而且水溶性多糖可能要發(fā)生水解，從節(jié)約能源考慮，減少生產(chǎn)周期考慮，從經(jīng)濟考慮適宜提取時間選擇3 h左右為宜。

2.2 提取溫度對女貞子水溶性多糖提取率的影響

提取時間是影響女貞子提取率的重要因素，且影響成本。固定溫度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分別回流1 h后，過濾，濾渣然后在80℃，固定料液比 1∶20 下，分別在 65、70、75、80、85、90、95、98℃下，回流1 h進行提取，試驗結果見圖2。

由圖2中可知，在85℃前，多糖提取率隨溫度的升高而增大，在80℃前增加較為顯著，以后增加不太明顯，溫度在80、85、90℃的提取率曲線較為平緩，同時從提取的多糖溶液可以看出，隨著溫度的升高，多糖溶液顏色加深。考慮到高溫可能對多糖的結構與活性有一定的影響，溫度過高多糖易產(chǎn)生降解，而且溫度過高，水分容易揮發(fā)，給操作帶來不便，所以適宜提取溫度選擇85℃左右作為宜。

2.3 料液比對女貞子水溶性多糖提取率的影響

料液比對提取率具有重要影響，水量多有利有水溶性多糖的擴散傳質，但水量過多增加蒸發(fā)處理的困難。固定溫度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分別回流1 h后，過濾，濾渣然后在在80℃，料液比分別為 1∶8、1∶12、1∶16、1∶20、1∶24、1∶28、1∶32（g/mL）下回流1 h進行試驗，試驗結果見圖3。

由圖3中可看出，多糖提取率隨料液比的增加先增大后減小，在1∶16時有最大值，然后隨著料液比的增加，提取率不在增加，并且有下降的趨勢，因此最佳提取料液比選擇1∶16左右為宜。

2.4 提取次數(shù)對女貞子水溶性多糖提取率的影響

提取次數(shù)決定操作成本，操作次數(shù)越多，成本越高，且工藝用水量大。固定溫度80℃，用30 mL石油醚和80 mL 90%乙醇分別回流1 h后，過濾，濾渣在固定料水比 1∶20，分別提取 1、2、3、4 次，測定提取率，試驗結果見圖4。

由圖4可知，提取次數(shù)的增多能增加提取總量，在提取一次后，殘渣中水溶性多糖含量明顯降低，提取4次后其多糖提取率已經(jīng)很低。從節(jié)省能耗、減少操作工序以及縮短生產(chǎn)周期考慮，提取次數(shù)取2次為宜。

2.5 響應面法優(yōu)化提取工藝條件

根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設計原理[15]，綜合單因素影響試驗結果，選取提取溫度、料水比、提取時間對女貞子水溶性多糖提取率影響顯著的三個因素，在單因素試驗的基礎上采用三因素三水平的響應面分析方法進行試驗設計，分析因素與設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平表Table 1 Factor and level of RAS

對提取溫度，料水比，提取時間作如下變換X1=（T-85）/10，X2=（t-2）/1，X3=（z-16）/4，以 3 次試驗所得水溶性多糖提取率的平均值為響應值（Y），試驗設計與試驗結果見表2。

表2 響應面試驗設計及數(shù)據(jù)處理Table 2 Program and experimental results of RSA

其中15個試驗中，1-12是析因試驗，13-15是中心試驗，用來估計試驗誤差。采用SAS8.0軟件處理得響應面分析結果見圖5～圖7。

采用SAS RSREG程序對響應值與各因素進行回歸擬合后，得到回歸方程：

表3 女貞子水溶性多糖浸提回歸分析結果Table 3 Results of regression analysis

注：＊為顯著（P＜0.05）；＊＊為高度顯著（P＜0.01）。

回歸模型中各變量對指標（響應值）影響的顯著性，由F檢驗來判定，概率P（F＞Fα）的值越小，則相應變量的顯著程度越高。由表3可以看出，各因素中一次項 X1、X2、X3是高度顯著的，二次項 X1X1、X2X2、X3X3也是高度顯著的，其次是交互項X1X2、X1X3是顯著的，由此可見，各具體實驗因子對響應值的影響不是簡單的線性關系?；貧w模型也是高度顯著的,相關系數(shù)R2=3.4221/3.4610=98.88%,說明響應值（提取率）的變化有98.88%來源于所選變量，即提取溫度、提取時間和料水比。因此，回歸模型可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以利用該回歸方程確定最佳提取工藝條件。對回歸方程取一階偏導數(shù)等于零，整理可得如下3式：

式（1）、式（2）、式（3）聯(lián)立方程組，解得 X1=0.823，X2=0.748，X3=-0.227，代入前述的變換公式得到提取溫度 T=93.23 ℃，提取時間 t=2.75 h，水料比 Z=1∶15.09，但考慮到實際操作的便利，將女貞子水溶性多糖的最佳提取條件工藝修正為提取溫度94℃，料水比1∶15，提取時間3.0 h，提取次數(shù)為2次。在此修正條件下，一次實際測得提取率為5.260%，回歸模型預測提取率理論值可達5.053%。實際測定值比理論預測值高3.94%。

2.6 驗證試驗結果

在最佳提取溫度94℃，最佳料水比1∶15，最佳提取時間3.0 h的工藝條件下，進行提取試驗，3次試驗結果見表4。

表4 最佳工藝條件下的試驗結果Table 4 Test results in regression analysis

2.7 結論

通過單因素試驗設計，以及在此基礎上通過設計三因素三水平響應面法實驗，建立了響應值與各因素之間的數(shù)學模型，依此模型可以預測理論提取率。根據(jù)此二次回歸模型，確定女貞子水溶性多糖的提取最佳工藝參數(shù)：料水比1∶15，浸提溫度94℃，浸提時間3.0 h，浸提2次。按照此工藝條件提取女貞子水溶性多糖的提取率較高，女貞子水溶性多糖的實際一次提取率可達5.260%。

[1]張振明，葛斌，許愛霞，等.女貞子多糖的抗氧化活性研究[J].中國藥師，2005，8(6)：489-491

[2]李璘，丁安偉,孟麗.女貞子多糖的免疫調節(jié)作用研究[J].中藥藥理與臨床，2001，17(2)：11-12

[3]阮紅，呂志良.女貞子多糖免疫調節(jié)作用研究[J].中國中藥雜志，1999，24(11)：691-693

[4]馬學青，周勇,嚴宣佐，等.女貞子多糖免疫增強作用的體外實驗研究[J].中國免疫學雜志，1996，12(2)：101-103

[5]于魯剛,郝麗梅,楊明.女貞子多糖的提取及對小鼠免疫功能的影響[J].中國藥學雜志,1992，27(1)：26-27

[6]張振明，蔡曦光,葛斌，等.女貞子多糖和菟絲子多糖的協(xié)同抗衰老作用及其機制[J].中國藥理學通報，2005，21(5)：587-590

[7]張振明，葛斌,許愛霞，等.女貞子多糖的抗衰老作用[J].中國藥理學與毒理學雜志，2006，20(2)：108-111

[8]張興輝，石力夫.不同產(chǎn)地女貞子中多糖的含量測定[J].藥學服務與研究，2004，4(1)：14-17

[9]吳道遒，孫燕.女貞子化學成分的研究[J].中草藥，1993，24(1)：4，37

[10]阮紅.女貞子多糖對小鼠淋巴細胞IL-2誘生的調節(jié)作用[J].上海免疫學雜志，1999，19(6)：337-338

[11]范榮車,任濤,劉成柏，等.不同溶劑提取五味子多糖體外生物活性研究[J].中成藥，2008，30(3)：432-434

[12]李亞娜,林永成,佘志剛.響應面分析法優(yōu)化羊棲菜多糖的提取工藝[J].華南理工大學學報：自然科學版，2004，32(11)：29-31

[13]劉洋，趙謀明，楊寧，等.響應面分析法優(yōu)化仙人掌多糖提取工藝的研究[J].食品與機械，2006，22(6)：42-45

[14]王強，陳綏清，張志華.枸杞子中多糖的含量測定[J].中草藥，1991，22(2)：67-68

[15]吳有煒.試驗設計與數(shù)據(jù)處理[M].蘇州：蘇州大學出版社，2002：115-154

Optimization of the Extraction Technique of Water-soluble Polysaccharide from Fructus Ligustri Lucidi by Response Surface Methodoloy

HUANG Bao-xu,LIU Jun-hai,ZHANG Jing
（School of Chemistry and Chemical Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China）

2010-04-26

黃寶旭（1973—），男（漢），副教授，博士，研究方向：植物活性成分分離純化技術。