COPD大鼠氣道黏液分泌調(diào)控機(jī)制及“從腸論治”干預(yù)作用＊

鐘相根，李宇航，張 前，賈 旭，孫 燕，鄭豐杰，謝 華，劉曉輝，王 蔚，祝小惠，周曉衛(wèi)，田 彥

（北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，北京 100029）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronicobstructive pulmonary disease，COPD）以氣道不完全可逆性氣流受限為特征，氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展，與肺對(duì)有害氣體或有毒顆粒的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，可伴有氣道高反應(yīng)性［1］。氣道黏液高分泌是氣道阻塞的主要因素之一，是目前COPD發(fā)病機(jī)制研究的熱點(diǎn)，認(rèn)為氣道黏液高分泌已成為影響COPD病情和預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素［2］，氣管、支氣管樹(shù)杯狀細(xì)胞化生是黏蛋白的主要來(lái)源，也是黏液過(guò)度分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。杯狀細(xì)胞主要分泌黏蛋白5AC（MUC5AC）。目前認(rèn)為，杯狀細(xì)胞化生及其MUC5AC基因表達(dá)的關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)涉及白介素-13（IL-13）和表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）信號(hào)傳導(dǎo)通路。

本課題組在“肺與大腸相表里”臟腑相關(guān)理論指導(dǎo)下，采用氣管內(nèi)注脂多糖和熏煙的復(fù)合法建立慢性阻塞性肺疾病大鼠模型，在觀察了“通利大腸”可改善COPD大鼠肺功能、組織病理?yè)p傷、氧化應(yīng)激損傷及可抑制氣道黏液高分泌的基礎(chǔ)上［3、4］，進(jìn)一步觀察“從腸論治”對(duì)COPD大鼠氣道黏液分泌信號(hào)調(diào)控的影響，探討COPD“從腸論治”的效應(yīng)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 藥物

采用清·吳鞠通《溫病條辨·卷二》宣白承氣湯（生石膏五錢(qián)、生大黃三錢(qián)、杏仁粉二錢(qián)、栝樓皮一錢(qián)五分），主要功效宣肺化痰，通腑泄熱。按文獻(xiàn)進(jìn)行藥量折算后根據(jù)藥物功效與歸經(jīng)將宣白承氣湯拆分為3組：治肺組（生石膏15g，苦杏仁6g，栝樓皮4.5g）、治腸組（生大黃 9g）、肺腸同治組（生石膏15g，苦杏仁 6g，栝樓皮 4.5g，大黃 9g）。

中藥全部購(gòu)自北京同仁堂藥店，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論與關(guān)鍵技術(shù)研究中心鑒定均為正品。生藥劑量比例按原著換算，依照人單位體重生藥量求得大鼠單位體重生藥量，并擴(kuò)大10倍。各組藥物分別以蒸餾水煎煮30min，提取2次，再合并煎液，并將所得藥液用雙層紗布過(guò)濾，水浴加熱蒸發(fā)濃縮，貯于冰箱中備用。

1.2 動(dòng)物與分組

清潔級(jí)健康 Wistar雄性大鼠，40只，鼠齡10～12周，體重230g±20g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，合格證號(hào)SCXK（京）2009-0011。動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)7d后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，分為正常組、模型組、治腸組、治肺組、肺腸同治組，每組8只。

各給藥組動(dòng)物，第15～28天每天1次灌胃給予相應(yīng)藥液，正常組及模型組給予等量0.9％生理鹽水，連續(xù)14d。各組于末次給藥后，禁食12h檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

1.3 COPD大鼠模型的制作

［5］采用氣管注脂多糖加熏香煙方法：在第1天和第14天，用1％的戊巴比妥鈉（40mg/kg）腹腔注射麻醉，仰臥位固定于大鼠固定板，暴露聲門(mén)，將18號(hào)靜脈套管針快速插入氣管，拔出針芯，用1ml注射器注入溶于生理鹽水的 LPS 200μl（1mg/ml），然后將大鼠固定板直立旋轉(zhuǎn)，使 LPS能夠均勻分布于兩肺。正常組注入生理鹽水。第2～第28天（第14天除外），將大鼠置入60cm×50cm×40cm熏吸箱內(nèi)，注入大前門(mén)牌過(guò)濾嘴香煙煙霧，濃度約5％，每天上午、下午各1 h。檢測(cè)用力肺活量（FVC）、第 0.3秒用力呼氣容積（FEV 0.3）、第0.3秒用力呼氣容積與用力肺活量的比（FEV0.3/FVC）、用力中期呼氣流速（FEF25-75）、最大呼氣中期流速（MMF）、用力最大呼氣流速（PEF）等肺功能相關(guān)指標(biāo)。

1.4 儀器與試劑

Light Cycler 2.0實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche診斷公司）；動(dòng)物熏吸箱（60 cm×50 cm×40 cm），自制；18號(hào)靜脈套管針（馬來(lái)西亞制造）。脂多糖，LPS，Sigma公司。大前門(mén)牌香煙，上海煙草公司，烤煙型，焦油量12mg，煙氣煙堿量0.9mg，煙氣一氧化碳量14mg。Trizol RNA提取試劑，Invitrogen公司；M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，Promega公司；SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒，Roche公司；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.5 Realtime-PCR法檢測(cè)氣道EGF-R及IL-13 mRNA的表達(dá)

總RNA提取：取肺組織約100mg，按照Trizol試劑說(shuō)明，采用異硫氰酸胍一步法抽提組織總RNA，所提總RNA經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳確定其完整性，并經(jīng)紫外分光光度計(jì)檢測(cè)所提RNA含量（3μg）和純度（1.8～2.0）。

cDNA合成：分別取3μg總 RNA為模板，在加入Oligo（dT）和M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶后以25μl體系在42℃下反應(yīng)1h合成 cDNA第1鏈，之后94℃加熱3min以滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增：采用SYBR Green I熒光染料技術(shù)，在 20μl反應(yīng)體系中，加入 cDNA 2μl、ddH2O 13μl、SYBR Green 熒光定量 PCR Mix 4μl、引物 1μl：EGF-R：上 游 引 物：5 ＇-CCC AGT CTA TCA CAA TCA GCC-3＇，下游引物：5＇-GCC CTT AAA GAT GCC ATT CG-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：247bp。IL-13：上游5′-ATC ACA CAA GAC CAG AAG ACT TC-3′，下游5′-AAC TGG GCT ACT TCG ATT TTGG-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：195bp。用 β-actin基因作為內(nèi)參，β-actin上游引物 5′-GAC ATC CGT AAA GAC CTC TAT GCC-3＇，下游 引 物 5′-CTC TGT GTG GAT TGG TGG CTC TAT-3＇，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：170bp。

反應(yīng)條件：94℃ 10min、94℃ 10s、54℃ 10s、72℃10s，45個(gè)循環(huán)。然后做溶解曲線以確認(rèn)是否是單一峰。反應(yīng)結(jié)束后，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物是否符合原設(shè)計(jì)片段長(zhǎng)度。PCR反應(yīng)及數(shù)據(jù)采集在LightCycler 2.0系統(tǒng)上進(jìn)行，記錄其循環(huán)閾值（CT），每個(gè)樣品中靶基因的相對(duì) mRNA表達(dá)采用相對(duì)定量公式 2－ΔΔCT計(jì)算，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組（Ct靶基因 －Ctβ-actin）－ 對(duì)照（Ct靶基因 －Ctβ-actin）。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠肺功能檢測(cè)結(jié)果

與正常組相比，模型組大鼠 FVC、FEV0.3、FEV0.3/FVC、FEF25-75、MMF、PEF 降低，提示模型組氣道阻力增加，氣流受限。與模型組比較，用大黃通利大腸的治腸組肺功能顯著改善。與治肺組比較，增加了治腸的肺腸同治組肺功能改善作用增強(qiáng)。結(jié)果已另文發(fā)表，見(jiàn)參考文獻(xiàn)［3］。

2.2 各組大鼠氣道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA的表達(dá)

表1顯示，模型組大鼠氣道 EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，與正常組比較差異有顯著意義（P＜0.01），說(shuō)明COPD大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白高分泌增強(qiáng)。

表1 各組大鼠氣道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA表達(dá)±s）

表1 各組大鼠氣道EGF-R mRNA及IL-13 mRNA表達(dá)±s）

注：與正常組比較：*P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.01；與治肺組比較：※P＜0.01

組 別n EGF-R mRNA IL-13 mRNA正 常 組8 0.240±0.077 0.167±0.051模 型 組 8 2.129±0.287* 2.080±0.624*治 腸 組 8 0.753±0.134# 1.101±0.207#治 肺 組 8 1.156±0.214 0.821±0.233肺腸同治組 8 0.520±0.077※ 0.382±0.124※

治腸組EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)降低，與模型組比較有顯著差異（P＜0.01），提示“從腸論治”能抑制COPD大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白分泌的信號(hào)傳導(dǎo)通路，減輕氣道黏液分泌及氣道阻塞，緩解氣流受限。

與治肺組比較，加上“從腸論治”的肺腸同治組EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)降低（P＜0.01）。提示在治肺的基礎(chǔ)上增加通利大腸，抑制氣道黏液高分泌信號(hào)傳導(dǎo)作用增強(qiáng)，有利于進(jìn)一步改善氣道通氣及肺功能。

3 討論

杯狀細(xì)胞化生和黏液過(guò)度分泌是COPD氣道慢性炎癥重要的病理改變，過(guò)度分泌的黏液潴留于氣道，加重了業(yè)已狹窄氣道的阻塞，加速了肺功能的下降進(jìn)程，易導(dǎo)致氣道內(nèi)感染的發(fā)生且不易控制，直接導(dǎo)致病情的惡化乃至死亡。近年的臨床病理研究也顯示，COPD病情惡化死亡患者肺組織基本都可見(jiàn)到小氣道黏液的潴留乃至黏液栓的形成，提示小氣道黏液潴留是病情惡化的重要形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。氣道黏液高分泌的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)被認(rèn)為是上皮杯狀細(xì)胞的廣泛化生和黏膜下支氣管腺的肥大，而在小氣道，由于缺乏支氣管腺增生的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其黏液高分泌主要由增生、化生的杯狀細(xì)胞所致。杯狀細(xì)胞化生的關(guān)鍵介導(dǎo)環(huán)節(jié)涉及白介素（IL）-13和表皮生長(zhǎng)因子（EGF-R）受體［6～8］。

正常氣道上皮接觸環(huán)境刺激物，可產(chǎn)生炎癥/免疫反應(yīng)介質(zhì)，一些介質(zhì)有促分泌功能，激活表面杯狀細(xì)胞分泌黏蛋白，一些介質(zhì)可上調(diào)黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄。上調(diào)黏蛋白基因轉(zhuǎn)錄是持續(xù)黏蛋白生物合成和高分泌所必需的過(guò)程。杯狀細(xì)胞主要分泌 MUC5AC。IL-13是體內(nèi)有力的黏液刺激物，IL-13引起大鼠氣道上皮MUC5AC表達(dá)上調(diào)，除了IL-4受體途徑外，同時(shí)有EGFR表達(dá)的增強(qiáng)，給予EGFR酪氨酸激酶抑制劑BBX1522可抑制 MUC5AC表達(dá)，表明IL-13引起氣道黏液高分泌也通過(guò)EGFR途徑。此外，IL-13也可直接驅(qū)動(dòng)黏蛋白基因表達(dá)。許多細(xì)胞因子制作的黏液高分泌氣道炎癥模型均通過(guò)產(chǎn)生IL-13來(lái)實(shí)現(xiàn)。研究顯示，TH2細(xì)胞缺乏IL-13不能刺激產(chǎn)生黏液，而EGFR信號(hào)傳導(dǎo)通路是眾多刺激因子如吸煙、過(guò)敏原、氧化應(yīng)激、細(xì)菌感染、細(xì)胞因子等誘導(dǎo)MUC5AC基因表達(dá)的共同通路。

本課題組以往研究發(fā)現(xiàn)，“通利大腸”可抑制COPD大鼠氣道黏液高分泌，但其影響?zhàn)ひ悍置诘恼{(diào)控機(jī)制還有待深入研究。因此，本實(shí)驗(yàn)選用宣白承氣湯，進(jìn)一步拆方觀察其治肺組、治腸組及肺腸同治組對(duì)COPD大鼠氣道黏液分泌信號(hào)調(diào)控機(jī)制的影響，并著重對(duì)比分析增加“從腸論治”因素對(duì)此的干預(yù)作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組相比，COPD組大鼠氣道EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，提示模型組大鼠氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白表達(dá)增強(qiáng)。與模型組比較，用大黃“從腸論治”的治腸組 EGF-R mRNA、IL-13 mRNA表達(dá)降低。與治肺組比較，增加了治腸的“肺腸同治”組抑制氣道杯狀細(xì)胞化生及黏蛋白表達(dá)信號(hào)傳導(dǎo)作用。因此，通利大腸或在治肺的基礎(chǔ)上增加通利大腸，均能增強(qiáng)抑制 COPD大鼠氣道氣道杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號(hào)調(diào)控的作用，從而進(jìn)一步改善氣道通氣及肺功能。

綜上所述，通過(guò)“從腸論治”通腑宣肺，抑制COPD氣道上皮杯狀細(xì)胞化生及黏液高分泌信號(hào)傳導(dǎo)，進(jìn)而抑制黏液高分泌，改善氣道阻塞及減少病原菌定植，這可能是“通利大腸”改善COPD大鼠肺功能的效應(yīng)機(jī)制之一，有助于進(jìn)一步探討肺腸之間效應(yīng)互動(dòng)的聯(lián)絡(luò)機(jī)制。

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△通訊作者：李宇航，醫(yī)學(xué)博士，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師，從事中醫(yī)辨證論治規(guī)律研究。北京市朝陽(yáng)區(qū)北三環(huán)東路11號(hào)北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，郵編：100029，E-mail：liyuhang@bucm.edu.cn。