益氣方干預(yù)化療所致免疫功能低下作用機(jī)理的研究＊

蘇 穎，郭 焱，朱 娜，顧紅纓，李春子

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長春 130117）

惡性腫瘤發(fā)病率呈逐年增高趨勢，手術(shù)和放化療成為腫瘤的主要治療手段，CY是目前應(yīng)用最廣泛的烷化劑類抗腫瘤藥，通過影響腫瘤細(xì)胞的生長繁殖而達(dá)到治療目的，但包括CY在內(nèi)的化療藥物極易引起造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的損傷，影響惡性腫瘤的治療效果［1、2］。

腫瘤患者術(shù)后化療造成的毒副作用嚴(yán)重影響術(shù)后治療與康復(fù)，特別是血中WBC等明顯減少對機(jī)體免疫機(jī)能產(chǎn)生嚴(yán)重影響，因此，采取有效措施防治化療的毒副反應(yīng)，越來越引起廣泛關(guān)注。而中藥能夠提高化療患者機(jī)體免疫力，對血中WBC等的生成有較好的促進(jìn)作用，其研究已引起醫(yī)學(xué)界的重視［3～5］。

中藥對化療所致血中WBC等減少的治療研究，近年來取得了一定的進(jìn)展，但是治療進(jìn)展比較緩慢，雖有相關(guān)報道，但均處于探索階段［6～8］。

惡性腫瘤患者常伴有不同程度的正氣虛弱，免疫力較正常人低下，加之術(shù)后化療后，免疫力嚴(yán)重低下，血中紅WBC等數(shù)量嚴(yán)重不足，直接影響腫瘤術(shù)后治療及預(yù)后恢復(fù)。此種情況，運(yùn)用中醫(yī)學(xué)理論辨證，雖屬氣血兩虛，但重在氣虛，氣虛不能生血為其機(jī)理關(guān)鍵。許多研究資料表明，氣血不足尤其氣虛與免疫功能的表達(dá)與調(diào)節(jié)有著重要關(guān)系［9、10］。

1 材料與方法

1.1 材料

ICR小鼠體重18g～22g，雌雄各半，由本?；A(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心提供。益氣方是根據(jù)藥典配方調(diào)配，按湯劑常規(guī)煎藥、過濾。各飲片由本校附屬醫(yī)院提供。環(huán)磷酰胺，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司產(chǎn)品；EDTA-2Na，北京鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；小鼠GCSF試劑盒為美國BD公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組 取ICR小鼠，隨機(jī)分為模型組、空白對照組、益氣方高、中、低劑量組，每組10只小鼠，雌雄各半。實(shí)驗(yàn)環(huán)境條件符GB1495-94國家標(biāo)準(zhǔn)，室溫19℃ ～21℃，相對濕度40％ ～60％，每日光照12h，自由進(jìn)食飲水。

1.2.2 模型建立 給藥第8天開始給模型組、益氣方高、中、低劑量組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80mg·kg－1，連續(xù) 3d。

1.2.3 分組給藥 給藥組小鼠按劑量分別灌胃給藥，各組給藥劑量均按小鼠臨床等效量計(jì)算所得?？瞻讓φ战M與模型組小鼠同時灌服等容量生理鹽水，連續(xù)15d，給藥體積為30ml/kg體重，每日給藥1次。從第8天起模型組與給藥組小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺80mg·kg－1，連續(xù)3d，正常組小鼠同時注射等體積生理鹽水。

1.2.4 小鼠WBC水平的測定 于第15天末次給藥20h后小鼠行鼠眼球取血，加入EDTA-Na2抗凝劑抗凝，上全自動血液分析儀分析WBC水平。

1.2.5 淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（MTT法）小鼠脾細(xì)胞懸液的制備：將小鼠頸椎脫臼處死，無菌分離小鼠脾臟，置于預(yù)冷PBS中200目尼龍網(wǎng)研磨過濾，收集細(xì)胞，冷PBS離心（250g，5 min）洗滌細(xì)胞2次，再重懸于IMDM培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞密度為5×106/ml。

ConA誘導(dǎo)小鼠淋巴細(xì)胞增殖：將中細(xì)胞接種于96孔板，每孔200μl，分別設(shè)置對照組（只加入脾細(xì)胞和IMDM）以及不同濃度ConA刺激下的實(shí)驗(yàn)組（分別加入 ConA20μg/ml、10μg/ml、5μg/ml及脾細(xì)胞和 IMDM），每組含 5個復(fù)孔，孵育 42h。加入MTT5mg/ml，CO2孵育箱 6h。每孔加二甲基亞砜，充分震蕩，37℃孵育1h。570nm波長酶標(biāo)儀下測OD值，計(jì)算結(jié)果。SI（刺激指標(biāo)）=OD加樣孔/OD對照孔

1.2.6 小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）的測定 用ELISA法檢測小鼠外周血G-CSF水平，小鼠眼球取血，離心30min分離血清，放置 －20℃冰箱保存，進(jìn)行小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子的酶聯(lián)反應(yīng)。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行方差分析兩兩比較，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對小鼠WBC的影響

通過實(shí)驗(yàn)表明，注射環(huán)磷酞胺后小鼠的WBC顯著低于正常小鼠，表明其處于免疫抑制狀態(tài)。注射環(huán)磷酰胺并灌服益氣方的小鼠粒細(xì)胞數(shù)較模型組小鼠有明顯提高，尤以給予益氣方中劑量組，增加顯著，且達(dá)到正常對照水平（圖1）。提示益氣方可以抵消環(huán)磷酞胺引起的WBC減少癥狀及細(xì)胞免疫損傷，增強(qiáng)免疫損傷小鼠細(xì)胞的應(yīng)答能力，對機(jī)體低下的細(xì)胞免疫具有一定的恢復(fù)作用。

圖1 小鼠粒細(xì)胞水平檢測

2.2 對淋巴細(xì)胞增殖的影響（MTT法）

OD值換算成刺激指數(shù)后，將模型組與空白組比較，P＜0.05，提示造模成功；高劑量組與模型組比較P=0.25＞P0.05，沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；中、低劑量組與模型組比較，結(jié)果P＜0.05，皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖2），說明中、低劑量給藥即可促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖。

2.3 對小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，模型組與空白組比較，有顯著性意義，即造模成功；益氣方高、中、低劑量組小鼠的G-CSF明顯回升，已達(dá)正常，與環(huán)磷酰胺模型組比較差異有顯著意義，高、中、低劑量進(jìn)行組間比較得，益氣方中劑量治療組差異顯著性最大（圖3），提示益氣方對CY化療小鼠所致的G-CSF減少有緩解作用，并能提高G-CSF水平，提高機(jī)體的免疫力。

圖2 淋巴細(xì)胞增殖結(jié)果

圖3 小鼠粒細(xì)胞集落刺激因子（G-CSF）含量

3 討論

CY是臨床廣泛應(yīng)用于惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤等惡性腫瘤的烷化劑抗腫瘤藥物，屬于細(xì)胞周期非特異性的烷化劑［11］，對整個周期中的細(xì)胞均具有殺滅作用，對腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞無選擇性，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞生長繁殖，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡和壞死，同時也能殺傷正常的組織細(xì)胞，從而對全身多種組織器官產(chǎn)生損傷，尤其是生長旺盛的骨髓造血細(xì)胞，因此CY很容易引起骨髓抑制，造血抑制。此外，CY也能對造血微環(huán)境造成不可逆性損傷，從而導(dǎo)致感染等后果，影響惡性腫瘤的治療效果［12、13］。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠血清G-CSF水平明顯下降，推測其原因可能為CY鼠化療造成機(jī)體廣泛性損傷而引起，而G-CSF活性的降低可能與骨髓抑制和白細(xì)胞減少，淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化減少的原因之一。

益氣方湯劑主要成分為黃芪、當(dāng)歸、鹿茸、阿膠、川芎、芍藥，具有益氣固表、補(bǔ)血活血之功。鹿茸增加鼠脊神經(jīng)組織的氧消耗，使呼吸商值增加，促進(jìn)糖酵解，對CY所致免疫功能低下小鼠的巨噬細(xì)胞吞噬功能均有刺激作用，對T淋巴細(xì)胞的激活有顯著作用［14］。人參明顯增加巨噬細(xì)胞的吞噬功能，對脾臟具有明顯的增重作用，是良好的強(qiáng)壯滋補(bǔ)藥。人參能促進(jìn)淋巴母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，作用于淋巴細(xì)胞的分化成熟過程而提高T、B淋巴細(xì)胞對分裂原的反應(yīng)。適當(dāng)濃度人參皂甙可明顯促進(jìn)淋巴細(xì)胞的有絲分裂，刺激小鼠網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的吞噬功能及促進(jìn)補(bǔ)體和抗體的生成，對特異性免疫和非特異性免疫、細(xì)胞免疫和體液免疫均有影響［15］，有利于機(jī)體增強(qiáng)免疫監(jiān)視功能，抑制癌瘤細(xì)胞的核酸代謝及“封閉抗體”的形成。黃芪能提高免疫功能低下小鼠NK細(xì)胞活性，對CY化療所致的 CD3、CD4和 CD8低下能升高至接近正常。通過促進(jìn)IL-2的產(chǎn)生而促進(jìn)而改善免疫細(xì)胞的功能［16］。芍藥是活血化瘀的代表藥之一，與CY合用對S180和L615具有明顯的協(xié)同作用。

綜上所述，上述6味中藥組成的益氣方，能上調(diào)CY化療所致的免疫功能低下，改善免疫細(xì)胞的功能，提高機(jī)體免疫力。其中，中劑量治療組組效果最為顯著，高劑量治療組次之，低劑量治療組效果再次之，有關(guān)機(jī)制尚需進(jìn)一步研究闡明。

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