心復(fù)康口服液對心衰大鼠心肌乳酸的影響＊

徐淑樂，曹雪濱△，張 剛，王艷飛，王洪良，何建成，胡元會，劉 偉，楊麥廣

（1.解放軍第252醫(yī)院 心內(nèi)科，河北 保定 071000；2.上海中醫(yī)藥大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，上海 201203；3.中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053）

正常心臟能量代謝主要為心肌細(xì)胞攝取脂肪酸及葡萄糖，并在線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生大量的三磷酸腺苷（ATP）供能。當(dāng)心肌能量代謝出現(xiàn)障礙時，心肌細(xì)胞對脂肪酸的氧化利用減少，對葡萄糖的氧化利用則增加。而心肌能量代謝障礙是心肌細(xì)胞損傷的始動環(huán)節(jié)，是引起和促進(jìn)心力衰竭發(fā)生、發(fā)展的重要因素。目前在心肌能量代謝研究的MRS包括磁共振氫譜（1H magnetic resonance spectroscopy，1HMRS）、磁共振磷譜（phosphours31magnetic resonance spectroscopy，31P-MRS）應(yīng)用較為廣泛。由于氫質(zhì)子較其他原子核在有機(jī)物結(jié)構(gòu)中具有高自然豐度和核磁感性，故氫質(zhì)子在磁共振波譜研究中應(yīng)用最多，1H-MRS可觀察到其他幾種MRS檢測不到的代謝物，且活體組織中的每種化合物幾乎都含有氫原子，因而1H-MRS含有大量信息。

本實驗通過建立慢性壓力負(fù)荷心衰大鼠模型，經(jīng)心復(fù)康口服液治療6、12周后，觀察心衰大鼠心功能變化，并運(yùn)用磁共振氫譜研究心復(fù)康口服液對慢性壓力超負(fù)荷大鼠心肌能量代謝物質(zhì)乳酸的影響，明確心復(fù)康口服液對心衰大鼠心肌能量代謝的影響，進(jìn)一步探討其治療CHF的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

BL-420E+生物信號采集系統(tǒng)（成都泰盟），LDR4-84C低溫離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠），YQ-3電動勻漿器（江蘇金壇市儀表儀器廠），恒溫培養(yǎng)振蕩器：ZHWY-100B（上海智誠分析儀器有限公司），超導(dǎo)核磁共振譜儀：Varian 600MHz（美國瓦里安公司，配備脈沖場梯度，帶梯度場的HFX探頭）。心復(fù)康口服液（中國人民解放軍第252醫(yī)院制劑中心，批準(zhǔn)文號北制字（2006）F17003，由人參、黃芪、丹參、附子、淫羊藿、靈芝等藥物組成，10ml/支，每毫升含生藥1.5g）。

1.2 模型制備、分組及給藥方法

雄性Wistar清潔級Ⅱ大鼠75只，體質(zhì)量200g±20g，由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號SCXK（軍）2007-004。本實驗采用隨機(jī)數(shù)字表法［1］，將90只雄性Wistar大鼠大鼠隨機(jī)分為3組，分別為假手術(shù)組、腹主動脈縮窄模型組、心復(fù)康口服液治療組，每組25只。參考Anversa、Anderson等方法制作腹主動脈部分縮窄致壓力超負(fù)荷性心肌肥厚導(dǎo)致充血性心力衰竭大鼠模型［2、4］。模型組和治療組：戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射（50mg/kg）麻醉，經(jīng)左脊肋角區(qū)入路，暴露左腎動脈起始部上端腹主動脈1cm，以直徑為0.7mm～0.8mm的不銹鋼探針與腹主動脈一起結(jié)扎，抽出探針形成腹主動脈狹窄50％～60％，縫合切口。同時腹腔內(nèi)注射青霉素10萬U預(yù)防感染；模型組用生理鹽水（1ml·100g－1·d－1）灌胃，治療組手術(shù)方法同模型組，用心復(fù)康口服液1ml·100g－1·d－1灌胃。假手術(shù)組：腹主動脈下穿線后打一松結(jié)，生理鹽水 1ml·100g－1·d－1灌胃。喂養(yǎng)6周后，各組取10只大鼠作為第6周研究組。喂養(yǎng)12周后，假手術(shù)組、模型組、治療組各死亡3、5、4只，均以剩余大鼠作為各組第12周研究對象。

1.3 心功能各項指標(biāo)的測定

戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射（50mg/kg）麻醉，通過BL-420E+生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，進(jìn)入血流動力學(xué)模塊。經(jīng)右側(cè)頸總動脈插管，描記動脈收縮壓（SAP）、動脈舒張壓（DAP）等。記錄完畢后繼續(xù)推入導(dǎo)管4.5cm～5.0cm至左心室，測定左心室舒張末壓（LVEDP）、收縮期左心室內(nèi)壓上升的最大變化速率（+dp/dtmax）和舒張期左心室內(nèi)壓下降的最大變化速率（－dp/dtmax）。立即剖胸取出心臟，部分左心室心尖組織（假手術(shù)組取相應(yīng)部分）行磁共振氫譜檢測，將左、右心房及右心室剪掉，預(yù)冷的PBS液沖洗，濾紙拭干后稱取左心室濕質(zhì)量。取心肌組織于液氮中保存?zhèn)溆?，計算左室質(zhì)量指數(shù)（LVMI）。

1.4 核磁共振波譜檢測1H

取液氮中已注明編號精確稱量的200mg左心室心尖組織大鼠心肌組織，用1∶1的 CH3CN：D2O混合溶劑勻漿，離心取上清液進(jìn)行水溶性物質(zhì)的提取，于40℃氮?dú)庀麓蹈?，取出干燥后的水提樣品，加?00μl D2O和60μl 0.1％的 TSP混勻，將配制好的溶液在 14000r/min離心 8min，取上清液移入5mm的核磁管中。對心組織水提物，采用有預(yù)飽和的1D presat脈沖序列，經(jīng)傅立葉變換轉(zhuǎn)換為NMR圖譜。對所得NMR數(shù)據(jù)經(jīng)傅立葉變換得到譜圖，然后調(diào)整相位并進(jìn)行基線校正。對組織水提物的數(shù)據(jù)0.405～9.405范圍內(nèi)的譜按照每段0.01ppm進(jìn)行分段積分。將積分按每張譜的總積分強(qiáng)度歸一化，所得數(shù)據(jù)輸出并轉(zhuǎn)換到Excel文件保存。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 心功能參數(shù)結(jié)果

2.1.1 6周時各組大鼠心功能結(jié)果 表1顯示，6 周時 CAA 組較 SH 組 HR、SAP、DAP、LVEDP、LVMI顯著升高（P＜0.01），+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著降低（P＜0.01），提示6周時 CAA組大鼠已出現(xiàn)明確心功能障礙。XFK組較CAA組HR、LVMI、DAP、LVEDP 顯 著 降 低（P＜0.01），+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著升高（P＜0.01），較 SH 組HR、DAP、LVEDP 顯 著 升 高（P＜0.01），+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著降低（P＜0.01），說明經(jīng)心復(fù)康口服液治療后CHF大鼠心功能得到改善。

表1 各組大鼠6、8周心功能指標(biāo)及心肌組織乳酸含量測定結(jié)果±s）

表1 各組大鼠6、8周心功能指標(biāo)及心肌組織乳酸含量測定結(jié)果±s）

注：與假手術(shù)組比較：aP＜0.05，bP＜0.01；與模型組比較：cP＜0.05，dP＜0.01；與同組6周時比較：eP＜0.05，fP＜0.01

組 別n SAP（mmHg）DAP（mmHg）LVEDP（mmHg）+dp/dtmax（mmHg/s）－dp/dtmax（mmHg/s） LVMI 乳酸假手術(shù)組6周 10 102.33±8.27 72.56±5.26 －10.56±2.77 3562.77±226.76 －3011.72±286.43 1.68±0.26 201.11±34.59 12周 12 110.43±9.57 70.78±6.44 －11.07±3.13 3598.29±168.33 －3152.67±307.65 1.69±0.18 192.62±29.10模型組6周 10 132.49±4.77b 98.56±5.87b 7.99±1.78b 1122.44±113.43b －889.65± 66.92b 2.88±0.28b 390.21±39.94b 12周 10 161.04±7.88be 116.71±6.77b 12.67±2.26be 792.55±155.66be －606.98±102.56be 3.82±0.18be 468.04±20.66bf治療組6周 10 129.07±8.47b 86.34±5.76bc 3.02±0.76bd 2139.77±235.10bd －2066.68±182.58bd 2.02±0.23d 277.70±27.54bd 12周 11 113.07±9.88de 79.66±7.76d －3.22±2.85bde 3021.27±288.29bdf－2585.79±309.02bde 1.72±0.16bde 180.08±37.39df

2.1.2 12周時各組大鼠心功能結(jié)果 表1顯示，12 周時 CAA 組較 SH 組 SAP、DAP、HR、LVEDP、LVMI顯著升高，+dp/dtmax、－dp/dtmax顯著降低（P＜0.01），而其中 LVMI、SAP、LVEDP 較 6 周時升高（P＜0.05），+dp/dtmax，－dp/dtmax較 6周時下降（P＜0.05），說明CAA組心衰大鼠隨時間的延長心功能障礙持續(xù)存在并呈惡化趨勢。XFK組SAP、LVMI、HR、DAP、LVEDP 較 CAA 組顯著降低（P＜0.01），+dp/dtmax、－dp/dtmax較CAA組顯著增高（P＜0.01）。XFK組較SH組LVEDP顯著升高（P＜0.01），+dp/dtmax、－dp/dtmax較 SH組顯著降低（P＜0.01）。XFK組大鼠 12周與 6周比較，LVMI、SAP、LVEDP 下降（P＜0.05），+dp/dtmax 顯著升高（P＜0.01），－dp/dtmax無明顯變化。證實隨著治療時間的延長，XFK組心衰大鼠心功能障礙得到進(jìn)一步改善。

2.2 磁共振氫譜檢測結(jié)果

2.2.1 6周時各組大鼠心肌組織乳酸水平變化 表1顯示，6周時模型組大鼠心肌乳酸水平較同期假手術(shù)組、心復(fù)康組顯著升高（P＜0.01），假手術(shù)組大鼠心肌乳酸水平較同期心復(fù)康組顯著降低（P＜0.01）。

2.2.2 12周各組大鼠心肌組織乳酸水平變化表1顯示，12周時，模型組大鼠乳酸水平較同期假手術(shù)組、心復(fù)康組均顯著升高（P＜0.01），其余各組間兩兩比較未見統(tǒng)計學(xué)差異。同組間比較，模型組大鼠心肌乳酸水平較6周時升高顯著（P＜0.01）。假手術(shù)組大鼠心肌乳酸水平較6周時無統(tǒng)計學(xué)差異，心復(fù)康組大鼠心肌乳酸水平較6周時顯著降低（P＜0.01）。

3 討論

縮窄腹主動脈法可通過以下因素造成明確的心功能衰竭：狹窄大鼠腹主動脈造成大鼠腎臟缺血，導(dǎo)致腎素生成增加。腎素作用于血管緊張素原，引起血管緊張素Ⅰ、Ⅱ的含量增加。血管緊張素Ⅱ是體內(nèi)最強(qiáng)的縮血管物質(zhì)，并且激活腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，引起水納代謝障礙，并通過對交感神經(jīng)的作用而使兒茶酚胺增加，使血壓升高，狹窄腹主動脈可直接使血壓升高，心臟后負(fù)荷加重，持續(xù)的心臟高負(fù)荷狀態(tài)，造成左室肥厚導(dǎo)致左心衰竭［5］。

造模后6周時CAA組較同期SH組大鼠HR、SAP、DAP、LVEDP、LVMI明顯升高，± dp/dtmax（P＜0.01），心功能指標(biāo)提示大鼠出現(xiàn)明確心力衰竭，證實模型復(fù)制成功（表1）。

心復(fù)康口服液是臨床治療充血性心力衰竭的經(jīng)驗方，該方由黃芪、人參、當(dāng)歸、丹參、淫羊藿、靈芝、川芎等組成，其中黃芪、人參具有健脾益氣之功效。經(jīng)藥理研究證實，黃芪具有強(qiáng)心作用，可使心臟收縮振幅增大，排血量增加，在心衰時黃芪強(qiáng)心作用更加明顯［6］。中醫(yī)理論認(rèn)為，“欲溫心陽，必助腎陽”，故用淫羊霍溫腎助陽，靈芝養(yǎng)神滋陰，以達(dá)補(bǔ)腎益心之目的。氣虛則血瘀，瘀血又可阻礙氣血的運(yùn)行，故加用丹參、當(dāng)歸、川芎理氣活血化瘀，以助氣血運(yùn)行。諸藥合用，共奏益氣溫陽，活血化瘀之功［7］。曹雪濱等研究了心復(fù)康口服液對大鼠缺血性心肌的影響［8］，實驗證實，心復(fù)康口服液對大鼠心肌能量代謝具有明確顯著的改善作用，有效的保護(hù)心肌缺血性損害，改善心功能。

乳酸（lactate，LAC）是能量代謝的低能通路，是細(xì)胞能量代謝缺乏的指標(biāo)。心肌能量代謝發(fā)生障礙時，脂肪酸氧化利用減少，葡萄糖氧化利用增加。由于糖酵解作為乳酸產(chǎn)生的主要途徑，葡萄糖氧化利用增加勢必會引起機(jī)體乳酸的增加。而乳酸的增加則會使肌肉中氫離子濃度上升，PH值下降，進(jìn)而引起一系列生化反應(yīng)［9］，可見乳酸的整個代謝過程維系著機(jī)體能量內(nèi)穩(wěn)態(tài)和氧化-還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)［10］。早在1988年Keller等就應(yīng)用1H-MRS對機(jī)體乳酸進(jìn)行過檢測研究，觀察到隨著1H-MRS檢測乳酸峰的出現(xiàn)，正常心肌的有氧代謝不能正常維持，心肌能量代謝便會出現(xiàn)障礙。我們運(yùn)用1H-MRS對大鼠心肌組織乳酸進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示6周時模型組大鼠心肌乳酸水平較同期假手術(shù)組、心復(fù)康組顯著升高（P＜0.01），假手術(shù)組大鼠心肌乳酸水平較同期心復(fù)康組顯著降低（P＜0.01）。12周時，模型組大鼠乳酸水平較同期假手術(shù)組、心復(fù)康組均顯著升高（P＜0.01）。同組間比較，模型組大鼠心肌乳酸水平6周時均呈明顯升高趨勢（P＜0.01）。可見，模型組大鼠心肌能量代謝障礙持續(xù)存在，并隨著時間的延長呈進(jìn)一步加重趨勢。假手術(shù)組大鼠心肌乳酸較6周時無統(tǒng)計學(xué)差異。心復(fù)康組大鼠心肌乳酸水平較6周時顯著降低（P＜0.01），進(jìn)而說明藥物對于大鼠心肌能量代謝障礙具有非常明顯的改善作用。

本研究結(jié)果進(jìn)一步證實，經(jīng)心復(fù)康口服液治療6、8周后的大鼠心功能明顯改善，同時顯著改善心衰大鼠心肌能量代謝，從而證實心復(fù)康口服液改善心衰大鼠心臟功能與其改善心肌能量代謝密切相關(guān)，對心肌能量代謝的改善作用可能是其治療充血性心力衰竭的重要機(jī)制之一，對其機(jī)理的深入研究有助于探討中醫(yī)藥治療心力衰竭多作用、多靶點(diǎn)機(jī)制，進(jìn)而為其在臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

［1］高歌，艾自勝.使用計算機(jī)隨機(jī)分組與隨機(jī)抽樣的方法及應(yīng)用［J］.中國衛(wèi)生統(tǒng)計，2002，19（1）：48-49.

［2］Anversa P，Olivetti G，Melissari M，et al.Morph metric study of myocardial hypertrophy induced by abdominal aortic stenosis［J］.Lab Invest，1979，40（3）：341-349.

［3］Anderson PG.Increased ischemic injury but decreased hypoxic injury in hypertrophied rat［J］.CircRes，1990，67（6）：943.

［4］王詠，肖穎彬.羅格列酮在壓力超負(fù)荷型大鼠肥厚心肌中抗炎作用的研究［J］.中國急救醫(yī)學(xué)，2006，26（1）：36-38.

［5］王艷飛，曹雪濱，崔英凱，等.改良大鼠左心室插管術(shù)及心衰大鼠左心功能指標(biāo)的測定［J］.中國比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（12）：34-36.

［6］沈映君.中藥藥理學(xué)［M］.上海：上?？萍汲霭嫔纾?997.164.

［7］何建成，曹雪濱，胡元會.淺析充血性心力衰竭的發(fā)病機(jī)理及心復(fù)康口服液的研制［J］.黑龍江中醫(yī)藥，1999，6：6.

［8］曹雪濱，李培建，黃河玲，等.心復(fù)康口服液對大鼠實驗性心肌缺血的保護(hù)作用［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，1998，29（增刊）：196-198.

［9］Keiko I.Proton MR spectroscopy of the brain with a focus on chemical issues［J］.Magnetic Resonance in Medical Science，2003，3：117-132.

［10］Leverve X，Mustafa I，Novak I，et al.Lactate metabolism in acute uremia［J］.J Ren Nutr，2005，15（1）：58-60.