扇貝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分離和性質(zhì)研究

李 偉，李麗莉，宋 月，金 橋，佟長青，張彥龍

(1.大連水產(chǎn)學(xué)院食品工程學(xué)院遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，遼寧大連116023;2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161)

扇貝消化腺β-1,3-葡聚糖酶的分離和性質(zhì)研究

李 偉1，李麗莉2，宋 月1，金 橋3，佟長青1，張彥龍2

(1.大連水產(chǎn)學(xué)院食品工程學(xué)院遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，遼寧大連116023;2.黑龍江大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，黑龍江哈爾濱150080;3.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧沈陽110161)

以扇貝加工廢棄物消化腺為原料，經(jīng)磷酸緩沖液抽提、80%飽和度硫酸銨沉淀、DE52纖維素離子交換層析和Sephadex G－100分子篩層析等步驟，獲得β－1，3葡聚糖酶。經(jīng)SDS－PAGE檢測，扇貝消化腺β－1，3－葡聚糖酶的相對分子質(zhì)量為157kDa。β－1，3－葡聚糖酶水解木耳多糖(β－1，3－葡聚糖)的最適 pH為7.0，最適溫度為30℃。通過Lineweaver－Burk作圖，得到其米氏常數(shù)Km為13mg/mL。

扇貝，β－1，3－葡聚糖酶，分離，酶學(xué)性質(zhì)

Abstract:The β－1，3－glucanase was isolated from digestive gland of scallop by precipitation with 80%saturation of(NH4)2SO4，ion－exchange on DE52 cellulose and gel filtration on Sephadex G－150.SDS－PAGE showed that β－1，3－glucanase has a molecular mass of 157kDa.The enzyme had optimal activity at pH7.0 and 30℃.The enzyme had apparent Km values of 13mg/mL by Lineweaver－Burk plot.

Key words:scallop;β－1，3－glucanase;isolation;enzymatic properties

近年來，遼寧省大力發(fā)展貝類養(yǎng)殖業(yè)，其中扇貝的養(yǎng)殖加工得到了長足發(fā)展。扇貝加工過程中，除利用可食部分外，內(nèi)臟被當(dāng)作廢棄物遺棄。扇貝內(nèi)臟可占其總重的15%，因此每年加工產(chǎn)生的廢棄物數(shù)量巨大。目前扇貝內(nèi)臟大部分被丟棄而沒有利用，這不但造成資源浪費(fèi)，還造成環(huán)境污染。扇貝屬于濾食性貝類，以浮游藻類和有機(jī)碎屑為食，因此內(nèi)臟中含有多種消化酶，包括含量豐富的葡聚糖酶［1］。葡聚糖酶在生物活性寡糖的分離純化、纖維素的降解、食品風(fēng)味的改善、藥物生產(chǎn)和乳糖酶缺乏的診斷等方面有重要用途［2］。所以，扇貝加工廢棄物是一種寶貴的生物酶資源。從扇貝內(nèi)臟中提取葡聚糖酶，可以有效地利用扇貝加工廢棄物，不僅能變廢為寶，而且為企業(yè)創(chuàng)造可觀的附加效益，降低生產(chǎn)成本，減少環(huán)境污染。本文以扇貝加工內(nèi)臟廢棄物消化腺為原料，分離提取了β－1，3－葡聚糖酶，并對提取條件和酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。通過本研究，可以為扇貝加工內(nèi)臟廢棄物的合理利用提供一些基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

扇貝 2009年3月購于大連長興農(nóng)貿(mào)市場;DE52纖維素 英國Whatman公司;Sephadex G－100

北京索萊寶(Solarbio)科技有限公司;木耳多糖遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室制備;其他化學(xué)試劑 均為國產(chǎn)分析純試劑。

DS－1高速組織搗碎機(jī) 上海標(biāo)本模型廠;GL－21M高速冷凍離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;721可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶制備 稱取20g的扇貝消化腺加入100mL的0.01mol/L pH7.4的磷酸緩沖液，在研缽中研磨至勻漿。靜置6h后，于4000r/min離心20min。取上清液加入(NH4)2SO4至80%飽和度，靜置過夜，4℃下于10000r/min離心20min，取沉淀，加入一定量0.01mol/L pH7.4的磷酸緩沖液溶解，即為粗酶液，用重蒸水透析3d，至檢測不出SO42－存在，4℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 β－1，3－葡聚糖酶活力和蛋白含量測定 根據(jù)Wang等的方法［3］測定。取 1.5mL木耳多糖溶液(1mg/mL)加入0.1mL酶液，再加入0.4mL蒸餾水，于40℃水浴中反應(yīng)1h，再加入1.5mL的3，5－二硝基水楊酸(DNS)試劑，于沸水浴中加熱5min，取出后迅速用流動水冷卻，再加入4.5mL蒸餾水，搖勻后在520nm波長下測吸光值(OD520nm)，以100℃水浴加熱5min的酶液作為空白。蛋白含量采用Folin－酚法測定［4］。

1.2.3 β－1，3－葡聚糖酶純化 將粗酶液進(jìn)行DE52纖維素離子交換層析(2.5×10cm)。0～1mol/L NaCl進(jìn)行梯度洗脫，對收集的層析峰進(jìn)行β－1，3－葡聚糖酶活力測定。將經(jīng)DE52纖維素離子交換層析所得到的具有 β－1，3－葡聚糖酶活力的層析峰進(jìn)行Sephadex G－100凝膠過濾層析(2.5×100cm)。對收集的層析峰進(jìn)行β－1，3－葡聚糖酶活力測定。將具有酶活力的層析峰合并透析凍干。

1.2.4 β－1，3－葡聚糖酶相對分子質(zhì)量測定 根據(jù)Laemmli［5］的方法，用 SDS－PAGE 測定 β－1，3－葡聚糖酶相對分子質(zhì)量。用15%聚丙烯酰胺作為分離膠，4%聚丙烯酰胺作為濃縮膠。分子量的測定是通過如下標(biāo)準(zhǔn)蛋白:磷酸化酶B(97.4kDa)、牛血清白蛋白(66.2kDa)、卵清蛋白(42.7kDa)、碳酸酐酶(31kDa)、胰蛋白酶抑制劑(20.14kDa)和α－乳清蛋白(14.4kDa)。

1.2.5 β－1，3－葡聚糖酶水解木耳多糖特性

1.2.5.1 β－1，3－葡聚糖酶水解木耳多糖的Km 取不同濃度的木耳多糖與β－1，3－葡聚糖酶混合，在40℃下反應(yīng)30min，以產(chǎn)物生成量表示反應(yīng)速度，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V 為縱坐標(biāo)作 Lineweaver－Burk圖，在橫坐標(biāo)上的截距為－1/Km。

1.2.5.2 pH對β－1，3－葡聚糖酶水解木耳多糖的影響 將底物溶于不同的pH(pH3.0～10.0)緩沖液中，加入β－1，3－葡聚糖酶溶液，在40℃下反應(yīng)30min后，測定產(chǎn)物生成的量。

1.2.5.3 溫度對β－1，3－葡聚糖酶水解木耳多糖的影響 將β－1，3－葡聚糖酶與木耳多糖混合，在20、30、40、50、60、70℃下反應(yīng) 30min 后，測定產(chǎn)物生成的量。

1.2.5.4 反應(yīng)時間對β－1，3－葡聚糖酶水解木耳多糖的影響 將β－1，3－葡聚糖酶與木耳多糖混合，在30℃下反應(yīng) 0.5、1、1.5、2、2.5、3h 后，測定產(chǎn)物生成的量。

2 結(jié)果與討論

2.1 β-1，3-葡聚糖酶純化

采用80%(NH4)2SO4沉淀、DE52纖維素離子交換層析和Sephadex G－100凝膠過濾層析等步驟，從扇貝消化腺中純化出β－1，3－葡聚糖酶(圖1)。純化出的 β－1，3－葡聚糖酶經(jīng)SDS－PAGE 測定，相對分子質(zhì)量為157kDa。

圖1 扇貝消化腺β－1，3－葡聚糖酶的純化

圖2 扇貝消化腺β－1，3－葡聚糖酶的SDS－PAGE結(jié)果

2.2 β-1，3-葡聚糖酶的酶學(xué)特性

木耳多糖是通過β－(1，3)糖苷鍵相連的葡萄聚糖，因此是 β－1，3－葡聚糖酶的最適底物［6］。β－(1，3)糖苷鍵相連的葡萄聚糖可以被β－1，3－葡聚糖酶水解，產(chǎn)生葡萄糖。生成的葡萄糖具有還原性，葡萄糖生成量可以用DNS檢測出來。取不同濃度的木耳多糖與β－1，3－葡聚糖酶混合，在40℃下反應(yīng)30min后，以產(chǎn)物生成量表示反應(yīng)速度，以1/［S］為橫坐標(biāo)，1/V為縱坐標(biāo)作 Lineweaver－Burk圖(圖3A)。得Km為13mg/mL。該酶水解木耳多糖的最適溫度為30℃，最適pH為7(圖3 B、C)。從圖3D可以看出，隨著反應(yīng)時間的增加，生成的還原糖的量也增加。

以扇貝加工內(nèi)臟廢棄物消化腺為原料，分離提取了 β－1，3－葡聚糖酶。利用 β－1，3－葡聚糖酶制備出木耳寡糖，為生產(chǎn)木耳寡糖提供了一個切實可行的途徑。木耳寡糖比木耳多糖具有更好的生物活性，如降血壓活性和抗氧化活性［7］。寡糖的制備一般采用酸解法，酸解法具有污染環(huán)境的缺點。而酶解法制備寡糖具有效率高，不污染環(huán)境的優(yōu)點。β－1，3－葡聚糖酶除了在寡糖的制備中應(yīng)用以外，還在糖苷化合物類藥物合成中有重要的應(yīng)用。通過從扇貝加工內(nèi)臟廢棄物消化腺分離提取了β－1，3－葡聚糖酶，也實現(xiàn)了貝類資源的合理利用。

圖3 扇貝消化腺 β－1，3－葡聚糖酶水解牡蠣多糖特性

3 結(jié)論

以扇貝加工廢棄物消化腺為原料，經(jīng)磷酸緩沖液抽提、80%飽和度硫酸銨沉淀、DE52纖維素離子交換層析和Sephadex G－100分子篩層析等步驟，獲得了β－1，3葡聚糖酶。β－1，3葡聚糖酶的獲得，使扇貝資源得到了更好和更深入的研究和利用。

［1］安賢惠，李聯(lián)泰，林春梅.幾種貝類消化酶活力的比較［J］.淮海工學(xué)院學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，16(1):57－59.

［2］龐中存，張永茂，黃玉龍，等.節(jié)桿菌β－1，3葡聚糖內(nèi)切酶的分離純化與特性研究［J］.食品與機(jī)械，2008，24(4):133－138，148.

［3］Wang J，Xu P，F(xiàn)incher G B.Purification，Characterization and gene structure of 1，3－β－glucanase isoenzyme GIII from barley(Hordeum vulgare)［J］.Eur J Biochem，1992，209:103－109.

［4］張龍翔，張庭芳，李令媛.生化實驗方法和技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，1997:137－138.

［5］Laemmli U K.Cleavage of structural protein during the assembly of the head of the bacteriophage T4［J］.Nature，1970，277:680－685.

［6］Zhang L，Yang L，Ding Q，et al.Studies on molecular weights of polysaccharides of Auricularia auricular－ judae［J］.Carbohydr Res，1995，270:1－10.

［7］郭平，盧家炯，林海霞.黑木耳多糖功效與提取方法［J］.中國林副特產(chǎn)，2006(6):72－74.

Isolation and properties of β－1，3－glucanase from digestive gland of scallop

LI Wei1，LI Li－li2，SONG Yue1，JIN Qiao3，TONG Chang－qing1，ZHANG Yan－long2
(1.Key Open Laboratory of Aquatic Products Processing and Utilization of Liaoning Province，College of Food Engineering，Dalian Fisheries University，Dalian 116023，China;2.College of Life Science，Heilongjiang University，Harbin 150080，China;3.College of Food Science，Shenyang Agriculture University，Shenyang 110161，China)

X714

A

1002－0306(2010)08－0170－03

2009－07－30

李偉(1964－)，男，教授，研究方向:食品生物技術(shù)。

遼寧省海洋與漁業(yè)廳科研計劃項目(200915);大連市科技局項目(2008J22JH015);遼寧省教育廳資助項目(2009A163)。