日照綠茶粗多糖脫蛋白研究

王傳名，董 祺，管從勝，*

(1.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟(jì)南250061;2.濟(jì)南老來壽生物技術(shù)有限公司，山東濟(jì)南250101)

日照綠茶粗多糖脫蛋白研究

王傳名1，董 祺2，管從勝1，*

(1.山東大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，山東濟(jì)南250061;2.濟(jì)南老來壽生物技術(shù)有限公司，山東濟(jì)南250101)

以日照綠茶粗多糖為原料，采用蛋白質(zhì)脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量為評價指標(biāo)，研究了Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對茶多糖粗提物脫蛋白的影響。實驗結(jié)果表明:Sevag法茶多糖含量較高、茶多糖保留率較低且操作較復(fù)雜，鞣酸法茶多糖保留率較高、蛋白質(zhì)脫除率較低，三氯乙酸法的脫蛋白效果最好。用三氯乙酸脫蛋白時，茶多糖溶液pH為4.0，蛋白脫除率為68.4%，茶多糖保留率為66.8%，茶多糖含量為72.5%。

日照綠茶，茶多糖，脫蛋白

Abstract:Rizhao green tea crude polysaccharides was used as material in this study.The effects of three deproteinization methodswere studied bythe deproteinization rate，polysaccharidesretention rate and polysaccharides content.The results showed that Sevag method had higher polysaccharides content，lower polysaccharidesretention rate and the operation was complicated.Digallic acid method had higher polysaccharides retention rate and lower deproteinization rate.The most effective method was trichloroacetic acid method.As the pH value of polysaccharides solution was 4.0 adjusted by trichloroacetic acid，the results were:the deproteinization rate 68.4%，the polysaccharides retention rate 66.8%and the polysaccharides content 72.5%.

Key words:Rizhao green tea;tea polysaccharides;deproteinization

茶作為中國最流行的飲料，其保健功能也越來越受到大家的重視。我國民間一直流傳著泡飲粗老茶可以治療糖尿病的說法。茶多糖是茶葉中的一種重要的生物活性組分，其降血糖功能早已被公認(rèn)?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究也表明，茶多糖具有降血糖、降血脂、抗凝血、抗血栓、降血壓、防輻射、增強機(jī)體免疫力及增加冠狀動脈血流量等多種功效［1－4］。茶多糖是由葡萄糖、阿拉伯糖、核糖、木糖、半乳糖、巖藻糖等單糖組成的雜聚糖［5－7］，在提取茶多糖的過程中，常會有大量的蛋白質(zhì)被一同提取出來，影響了茶多糖的純度。去除茶多糖粗提物中的蛋白一直是茶多糖純化過程中的一大難題。國內(nèi)外對茶多糖粗提物脫蛋白的方法研究主要有Sevag法、三氯乙酸法、鹽酸法、鞣酸法和酶法等［8－10］。目前，國內(nèi)市場上可銷售的茶多糖純度較低，含量僅為20%左右。若能從中低檔茶葉及粗老枝葉中提取純化出較高純度的茶多糖，并制成保健品，將會對茶葉的綜合利用和保健品市場有重要的意義。本文以日照綠茶粗多糖為原料，采用蛋白脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量為評價指標(biāo)，研究了Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對粗多糖脫蛋白的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

粗多糖 實驗室中以日照綠茶為原料，在提取分離茶多酚時富集水相中的茶多糖得到茶多糖粗提物;牛血清白蛋白、考馬斯亮藍(lán)G－250 美國Sigma公司;三氯乙酸、鞣酸、氯仿、正丁醇、蒽酮、濃硫酸、葡萄糖 均為國產(chǎn)分析純。

JP－A型電子天平 太倉市東亞天平儀器有限公司;HHS1－4型電子恒溫水浴鍋 北京長安科學(xué)儀器廠;SS－300型三足式離心機(jī) 江蘇張家港市南洋機(jī)械有限公司;TU－1901雙光束紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HY－4調(diào)速多用振蕩器 江蘇金壇市金城國勝實驗儀器廠;PHS－2C型數(shù)顯酸度計 杭州雷磁分析儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 茶多糖脫蛋白方法 以日照綠茶為實驗原料，采取水溶劑提取和乙酸乙酯萃取的方法分離茶多酚，同時以乙醇沉淀的方法富集水相中的茶多糖，得到粗多糖。

每次脫蛋白實驗稱取粗多糖3.0g，溶解在600mL去離子水中，得到濃度為5.0mg/mL的水溶液。

1.2.1.1 Sevag法脫蛋白 取100mL茶多糖水溶液6份，分別用 Sevag 試劑(氯仿∶正丁醇 =4∶1)處理 1、2、3、4、5和6次。每次加1/3體積的Sevag試劑，攪拌30min，靜置分離出下部有機(jī)層后，收集上層茶多糖水溶液，取樣測其糖含量和蛋白質(zhì)含量后，加3倍體積95%的乙醇沉淀，離心分離得到純化茶多糖，經(jīng)過冷凍干燥后稱重，計算茶多糖含量。

1.2.1.2 三氯乙酸法脫蛋白 取100mL茶多糖水溶液6份，分別用5%的三氯乙酸調(diào)節(jié)pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 和5.5，攪拌并靜置 2h 后，離心 15min，除去底部沉淀，收集上層茶多糖水溶液，取樣測其糖含量和蛋白質(zhì)含量后，加3倍體積95%的乙醇沉淀。離心分離得到純化茶多糖，冷凍干燥后稱重，計算茶多糖含量。

1.2.1.3 鞣酸法脫蛋白 取100mL茶多糖粗提物水溶液6份，分別用5%的鞣酸調(diào)節(jié)pH至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0和5.5，攪拌并靜置2h后，離心15min，除去底部沉淀，得到上層茶多糖水溶液，取樣測其糖含量和蛋白質(zhì)含量后，加3倍體積95%的乙醇沉淀。離心分離得到純化茶多糖，冷凍干燥后稱重，計算茶多糖含量。

1.2.2 茶多糖保留率、茶多糖含量和蛋白質(zhì)含量的測定

1.2.2.1 茶多糖保留率、茶多糖含量測定 采用蒽酮－硫酸法，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品、吸光度為縱坐標(biāo)和葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度與葡萄糖濃度的關(guān)系，得到線性回歸方程:

將待測的茶多糖配成濃度為1.0mg/mL的溶液，測定葡萄糖的含量，考察茶多糖保留率。因葡萄糖只是茶多糖中的一種，計算茶多糖含量時乘以校正系數(shù) 5.348［11］。

茶多糖的保留率(%)=W糖2/W糖1×100%

茶多糖含量(%)=W糖2/W×100%

W糖1、W糖2分別為脫蛋白前后茶多糖質(zhì)量，W 為脫蛋白后茶多糖樣品的質(zhì)量。

1.2.2.2 蛋白質(zhì)含量測定 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精確稱取牛血清白蛋白50.00mg，用少量蒸餾水溶解，定容至500mL，即為0.1mg/mL蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液，4～5℃冰箱中保存?？捡R斯亮藍(lán)G－250溶液配制:精密稱取考馬斯亮藍(lán)G－250 50.00mg，加入95%乙醇25mL，再加入85%磷酸50mL，最后用蒸餾水定容至500mL，即為0.1mg/mL的考馬斯亮藍(lán)G－250溶液，置于棕色瓶中備用。標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:采用考馬斯亮藍(lán)G－250法，以牛血清白蛋白作標(biāo)準(zhǔn)曲線。吸取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0mL 于具塞試管中，各加水至3mL，加入考馬斯亮藍(lán)G－250溶液15mL，混勻，放置10min，于595nm處測定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)、蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖2。蛋白質(zhì)測定:將待測的茶多糖配成濃度為1.0mg/mL溶液，測定吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算剩余蛋白質(zhì)含量，并計算蛋白脫除率。蛋白脫除率(%)=(W蛋白1－W蛋白2)/W蛋白1× 100%，W蛋白1、W蛋白2分別為脫蛋白前后蛋白質(zhì)質(zhì)量。

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)吸光度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，得線性回歸方程:

2 結(jié)果與討論

2.1 Sevag法脫蛋白的效果

Sevag法脫蛋白對蛋白質(zhì)脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量的影響見圖3。

圖3 Sevag法脫蛋白的效果

由圖3可以看出，隨著Sevag法脫蛋白次數(shù)的增加，茶多糖溶液中蛋白質(zhì)脫除率也是逐漸增加的。前3次處理中，蛋白質(zhì)脫除率增加的幅度較大，從第4次開始，增加的幅度放緩，且在6次處理后蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到61.3%。同時也可以看到，隨著脫蛋白處理次數(shù)的增加，茶多糖含量也是逐漸增加的，后兩次有所降低，在處理4次的情況下，茶多糖含量達(dá)到最高74.5%。糖溶液中茶多糖的保留率是逐漸下降的，6次處理后茶多糖的保留率僅為46.1%。

Sevag法用正丁醇和氯仿能使含有蛋白的溶液乳化，使蛋白質(zhì)變性而得以除去，能防止茶多糖的降解，所得茶多糖含量較高。但效率較低，需重復(fù)多次，茶多糖的損失量會較大，且氯仿是有毒物質(zhì)，易造成溶劑殘留和茶多糖的活性下降。從經(jīng)濟(jì)效益和安全衛(wèi)生角度考慮，Sevag法不適合茶多糖的脫蛋白處理。

2.2 三氯乙酸法脫蛋白的效果

三氯乙酸法脫蛋白對蛋白質(zhì)脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量的影響見圖4。

圖4 三氯乙酸法脫蛋白的效果

由圖4可以看出，隨著茶多糖液pH的增大，蛋白質(zhì)脫除率逐漸增加然后較大幅度地降低，茶多糖含量也是先增加然后降低，而茶多糖溶液中茶多糖的保留率是逐漸上升的。在pH為4.0時，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到最高68.4%，茶多糖含量最高為72.5%，此時茶多糖的保留率為66.8%。這說明pH4.0可能是日照綠茶粗多糖中雜蛋白的等電點，pH過大或過小都不利于蛋白的去除;從茶多糖保留率的變化規(guī)律也可看出，過酸的環(huán)境可能會造成茶多糖的降解增多。

三氯乙酸法是使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，與蛋白質(zhì)形成不溶性鹽，使之聚集沉淀，除蛋白效果較好，但反應(yīng)較為劇烈，易引起茶多糖的降解。無論是在蛋白質(zhì)脫除率上還是在茶多糖保留率上，三氯乙酸法都要比Sevag法好一些。

2.3 鞣酸法脫蛋白的效果

鞣酸法脫蛋白對蛋白質(zhì)脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量的影響見圖5。

圖5 鞣酸法脫蛋白的效果

由圖5可以看出，隨著茶多糖液pH的增大，蛋白質(zhì)脫除率和茶多糖含量都是逐漸增加然后降低，不過兩者的總體水平比三氯乙酸法明顯降低，而茶多糖溶液中茶多糖的保留率是逐漸上升的，這個指標(biāo)總體上比三氯乙酸法要稍高。在pH為4.0時，蛋白脫除率達(dá)到最高50.6%，茶多糖含量最高為65.3%，此時茶多糖的保留率為70.6%，也再次驗證了4.0是茶多糖粗提物中雜蛋白的等電點。

鞣酸法是利用單寧與蛋白質(zhì)形成沉淀，從而除去蛋白質(zhì)，反應(yīng)較為溫和，這也是它在這三種方法中茶多糖保留率最高的原因，但同時也可看到，鞣酸法的蛋白質(zhì)脫除率和茶多糖含量是這三種方法中最低的。

3 結(jié)論

采用Sevag法、三氯乙酸法和鞣酸法對日照綠茶粗多糖脫蛋白，結(jié)果表明:Sevag法茶多糖含量較高，但茶多糖保留率較低，并且需重復(fù)多次，效率低，有毒性溶劑殘留;鞣酸法茶多糖保留率較高，但脫蛋白率和茶多糖含量較低;三氯乙酸法在蛋白質(zhì)脫除率、茶多糖保留率和茶多糖含量三個方面的綜合指標(biāo)較理想，當(dāng)pH為4.0時，蛋白質(zhì)脫除率達(dá)到68.4%，茶多糖保留率為66.8%，茶多糖的含量為72.5%。

［1］汪東風(fēng)，謝曉鳳，王銀龍.茶葉多糖及其藥理作用研究進(jìn)展［J］.天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，1996，8(1):63－67.

［2］傅博強，謝明勇，周鵬.茶葉多糖的提取純化、組成及藥理作用研究進(jìn)展［J］.南昌大學(xué)學(xué)報:理科版，2001，25(4):358－364.

［3］Richard Bé liveau，Denis Gingras.Green tea:prevention and treatment of cancer by nutraceuticals［J］.The Lancet，2004，364:1021－1022.

［4］Marcel W L，Koo Chi H.Pharmacological effects of green tea on the gast rointestinal system ［J］.European Journal of Pharmacology，2004，500:177－185.

［5］Takeo Chui chi，Kinugasa Hitoshi.Extraction of hypoglyeemics from tea［J］.Japan，Kokai Tokkyo Kobo J P 04，1992，24(4)，139.

［6］王丁剛，王淑如.茶葉多糖的分離、純化、分析及降血脂作用［J］.中國藥科大學(xué)學(xué)報，1991 ，22(4):225－228.

［7］汪東風(fēng)，謝曉鳳，王世林，等.茶多糖的組分及理化性質(zhì)［J］.茶葉科學(xué)，1996，16(1):1－8.

［8］李峰，劉延吉，宗緒巖，等.草本刺嫩芽根多糖脫蛋白方法研究［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，34(1):9－10.

［9］劉成梅，萬茵，涂宗財，等.百合多糖脫蛋白方法的研究［J］.食品科學(xué)，2002，23(1):89－90.

［10］馬麗，覃小林，劉雄民，等.不同的脫蛋白方法用于螺旋藻多糖提取工藝的研究［J］.食品科學(xué)，2004，25(6):116－119.

［11］招鈺，周小玲，郭海燕，等.茶多糖中單糖組成比較［J］.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，34(4):547－550.

Study on deproteinization of Rizhao green tea crude polysaccharides

WANG Chuan－ming1，DONG Qi2，GUAN Cong－sheng1，*
(1.College of Chemistry and Chemical Engineering，Shandong University，Jinan 250061，China;2.Jinan Laolaishou Biotechnology Co.，Ltd.，Jinan 250101，China)

TS201.1

B

1002－0306(2010)08－0274－03

2009－09－22 *通訊聯(lián)系人

王傳名(1984－)，男，碩士研究生，從事植物資源提取純化研究。