小鼠Lewis肺癌原位模型的構(gòu)建

劉馨 伍治平 左曙光 周永春 陳艷 王熙才

動物模型的建立是研究非小細(xì)胞肺癌生物學(xué)特性和各種體內(nèi)治療實驗研究的基礎(chǔ)。該模型必須具備可重復(fù)性，并具備最為近似的腫瘤微環(huán)境及機(jī)體環(huán)境。Sheel等[1]以苯并芘對A/J小鼠灌胃構(gòu)建肺自發(fā)腫瘤模型，28周后解剖，僅有80%左右的成瘤率。國內(nèi)用類似方法誘發(fā)大鼠腫瘤，16周后才出現(xiàn)腫瘤，且腫瘤類型不一，包括鱗癌、腺癌等[2]。Zou等[3]用細(xì)針將人肺癌細(xì)胞系H358和H460送至裸鼠的氣管內(nèi)構(gòu)建肺癌原位移植模型，但其腫瘤生長部位、數(shù)目及大小都不穩(wěn)定。為建立簡易、穩(wěn)定、可重復(fù)性好的肺癌原位模型，本研究以3LL細(xì)胞系細(xì)胞直接接種于C57BL/6小鼠肺內(nèi)，并與皮下接種模型比較，對其穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)移特性及對小鼠肺原位癌模型構(gòu)建方法的優(yōu)化進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 3LL細(xì)胞的培養(yǎng)及生長曲線的繪制 3LL細(xì)胞株購自上海市胸科醫(yī)院胸部腫瘤研究所。用含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基，加雙抗（100 U/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素），置于37oC、5%CO2混合氣體孵箱中培養(yǎng)，每1天-2天換液，每3天傳代一次，傳代用0.25%胰酶消化。取1×104細(xì)胞接種于24孔板，每24 h計數(shù)，重復(fù)3孔，持續(xù)8天，計算每孔細(xì)胞均數(shù)，繪制生長曲線。

1.2 細(xì)胞懸液的制備 取對數(shù)生長期的3LL細(xì)胞，以0.25%的胰酶消化，收集細(xì)胞，離心去上清，用無菌生理鹽水洗滌兩次，將細(xì)胞懸浮于生理鹽水中，臺盼藍(lán)染色細(xì)胞活力測定大于90%，并進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度分別為2×105/mL、2×106/mL、2×107/mL，立即對小鼠進(jìn)行皮下接種及肺原位接種。

1.3 實驗動物和接種方法 實驗動物C57BL/6小鼠72只，雌雄各半，6周齡，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司［許可證號：syxk（京）2006-0024］。

24只小鼠采用皮下接種法，具體如下：①分組：將小鼠隨機(jī)分為3組，每組8只，其中2只于20 d時處死，行免疫組化檢測及流式檢測，另外6只用于生存曲線的監(jiān)測。第1組接種細(xì)胞總數(shù)為1×104，第2組接種細(xì)胞總數(shù)為1×105，第3組接種細(xì)胞總數(shù)為1×106。②接種：對小鼠左側(cè)腋下皮膚進(jìn)行酒精消毒，以1 mL注射器將50 μL細(xì)胞懸液注入小鼠左側(cè)腋下，稍停針后拔針。

48只小鼠采用原位接種法，具體如下：①分組：將小鼠隨機(jī)分為3組，每組16只，其中10只用于定時監(jiān)測腫瘤形成情況，另外6只用于生存曲線的監(jiān)測。第1組接種細(xì)胞總數(shù)為1×104，第2組接種細(xì)胞總數(shù)為1×105，第3組接種細(xì)胞總數(shù)為1×106。②麻醉：戊巴比妥鈉溶液50 mg/kg腹腔內(nèi)注射，將戊巴比妥鈉配成10 mg/mL的工作液，按0.05 mL/10 g體重劑量對小鼠進(jìn)行麻醉。③接種：小鼠麻醉后，將其仰臥固定在操作臺上，對小鼠前胸壁進(jìn)行酒精消毒，在左腋前線肋弓上約1.5 cm處作一約5 mm的小切口，分離皮膚及皮下組織暴露至胸壁，將50 μL細(xì)胞懸液與50 μL Matrigel混勻，在快凝固之前以胰島素注射針將3LL細(xì)胞與Matrigel混懸液共100 μL注入小鼠左肺，進(jìn)針約3 mm，注射完后停針5 s，拔針后縫合切口。

1.4 移植瘤生長的觀察和測量 定期觀察C57BL/6小鼠的精神、飲食、排便、體重和活動等情況，皮下接種組于腫瘤形成后第3天開始測量腫瘤大小，以游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑及短徑，以公式V=a2bπ/2（a為腫瘤的短徑，b為腫瘤的長徑）計算腫瘤大小。原位移植組分別在接種后第3、6、9、12、20天，處死2只小鼠，觀察腫瘤形成及轉(zhuǎn)移情況，并于第20天行免疫組化及流式檢測。

1.5 病理學(xué)檢測 留取小鼠腫瘤、肺臟、肝臟行病檢。病理HE染色按常規(guī)制備病理切片，二甲苯脫蠟2次，各10 min，無水乙醇洗去二甲苯2次，各1 min；95%酒精1 min，90%酒精1 min，85%酒精1 min，自來水沖洗2 min；蘇木精染色4 min，自來水沖洗1 min；1%鹽酸酒精分化20 s，自來水沖洗1 min；伊紅染色1 min，自來水洗30 s；70%酒精脫水20 s，90%酒精脫水30 s，95%酒精脫水2次，各1 min，無水乙醇2次，各2 min；二甲苯3次，各2 min；中性樹膠封片，顯微鏡下鑒定小鼠肺臟腫瘤灶。

1.6 免疫組化檢測及微血管密度（microvessels density,MVD）計算 免疫組化以石蠟切片按DAB染色試劑盒說明操作，一抗為抗CD31抗體。按照參考文獻(xiàn)中的方法計算微血管密度[4]。每張切片在低倍鏡（×100）下確定腫瘤內(nèi)5個血管密集區(qū)，再在高倍鏡（×200）下計數(shù)每個密集區(qū)中1個視野的微血管數(shù)，以5個區(qū)域微血管數(shù)的平均數(shù)作為微血管密度（MVD），在高倍鏡（×200）下拍照。

1.7 流式檢測 解剖小鼠分離腫瘤組織，研磨過濾收集單細(xì)胞懸液，以磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer solution, PBS）洗滌后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/mL，加入一抗（CD44v, Abcam）孵育0.5 h后，PBS洗滌，加二抗孵育0.5 h。PBS洗滌后上機(jī)檢測。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 結(jié)果采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析及方差分析，比較皮下組及原位接種組生存曲線、腫瘤微血管密度及CD44v的差異，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3LL細(xì)胞生長曲線 體外培養(yǎng)的3LL細(xì)胞在倒置顯微鏡下呈梭形（圖1），持續(xù)8天的細(xì)胞計數(shù)觀察發(fā)現(xiàn)3LL細(xì)胞于接種第3天逐漸進(jìn)入快速增殖期，第6天后增殖速度變緩（圖2）。

2.2 移植瘤的形成及動物的生存情況 皮下接種1×106劑量級的小鼠最先成瘤，術(shù)后第7天即可于大部分小鼠左側(cè)腋下觸及米粒大小腫塊，成瘤率100%；1×105劑量級小鼠于14天后成瘤，成瘤率66.7%；1×104劑量級小鼠20 d后成瘤，但成瘤率僅16.7%。小鼠惡液質(zhì)出現(xiàn)較晚，生存期較長，最長可達(dá)3個月，3組中位生存時間分別為82 d、72 d、50 d。后期腫瘤生長巨大，最大可達(dá)（6 769.44±815.35）mm3，并出現(xiàn)壞死（圖1、圖2）。

原位接種組1×106劑量級的小鼠最先成瘤，在術(shù)后3天解剖的2只小鼠中即有1只出現(xiàn)肺部肉眼可見的瘤結(jié)節(jié)，從第9天以后的所有老鼠均成瘤，12天出現(xiàn)對側(cè)肺的轉(zhuǎn)移，2周-3周后小鼠嚴(yán)重消瘦，行動困難，惡液質(zhì)狀態(tài)；1×105劑量級的小鼠在第9天解剖時有成瘤跡象；1×104劑量級的小鼠至12天開始才有成瘤跡象，成瘤率均為100%（圖3）。第3組小鼠于第22天時就開始出現(xiàn)死亡，其中位生存期為23 d，第2組小鼠中位生存期為35 d，第1組為38 d，存活最長者為50 d（圖4）。生存分析顯示原位組、皮下組組內(nèi)及組間比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05）。

2.3 病理檢查 皮下接種組腫瘤組織局部浸潤，侵及皮膚及肋骨，但未見遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移。原位接種組對小鼠肺組織進(jìn)行病理切片檢查，可見肺正常組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細(xì)胞。CD31免疫組化檢測微血管密度，接種第20天原位接種組（120.2±9.73）高于皮下組（92.6±7.12）（圖5，圖6）。

2.4 流式檢測 兩組腫瘤細(xì)胞均有CD44v的表達(dá)，原位接種組腫瘤細(xì)胞懸液（26.46±1.56）%表達(dá)高于皮下接種組（23.13±1.02）%（圖6）。

3 討論

大約80%的肺癌為非小細(xì)胞肺癌，化療和放療對非小細(xì)胞肺癌都缺乏有效的治療，因此探索肺癌的發(fā)病機(jī)制及新的肺癌治療方法意義重大，而進(jìn)行相關(guān)研究的基礎(chǔ)就在于肺癌模型的構(gòu)建。

圖 1 3LL細(xì)胞和皮下移植瘤A：光鏡下處于指數(shù)生長期的3LL細(xì)胞（100×）；B：皮下移植瘤（接種后3個月）。Fig 1 3LL cell and heterotopic lung cancerA: 3LL cells in the log phase under the light microscope (100×); B: Heterotopic lung cancer (3 months after transplanted).

圖 2 生長曲線A：3LL細(xì)胞生長曲線；B：皮下移植瘤生長曲線（腫瘤體積于接種后兩個月左右達(dá)到最大，后期因破潰，惡液質(zhì)等原因腫瘤體積會有所縮小）。Fig 2 Growth curvesA: Growth curve of 3LL cells; B: Growth curve of the heterotopic lung cancer (The volume of tumor would be maximum 2 months after transplanted and would be reduce at last because rupture and cachexia.).

圖 3 小鼠肺原位癌模型A、B：1×105劑量級的小鼠在第20天解剖時，形成界限分明的腫瘤，且可以看出下肺及對側(cè)肺的轉(zhuǎn)移瘤體；C、D：1×106劑量級的小鼠在第22天死亡后解剖時形成的腫瘤，小鼠兩側(cè)肺部受到嚴(yán)重浸潤。Fig 3 The orthotopic lung cancer model in miceA, B: A mouse received intrapulmonary inoculation of 1×105 of Lewis lung cancer cells into the left lung. 20 days after the tumor implantation, there are tumor in the lung.The boundary of the tumor is clear. At the same time, there are metastasis tumors in contralateral lung; C, D: A mouse received intrapulmonary inoculation of 1×106 of Lewis lung cancer cells into the left lung. 22 days after the tumor implantation, both lungs of the mouse were encroached badly by tumor.

圖 4 各組小鼠的生存曲線Fig 4 Survival curves of the mice in different groups

圖 5 CD31表達(dá)情況（免疫組化DAB染色，×200）A：皮下接種組；B：原位接種組。Fig 5 CD31 expression in different group (immunohitochemical DAB staining, ×200)A: Heterotopic group B: Orthotopic group.

圖 6 MVD計數(shù)和CD44v的表達(dá)A：微血管密度（MVD）；B：CD44v表達(dá)。Fig 6 MVD count and the expression of CD44vA: Microvessels density; B: CD44v expression.

小鼠肺腫瘤模型包括小鼠自發(fā)性肺腫瘤模型及移植瘤模型。其中，小鼠自發(fā)性肺腫瘤模型與人肺癌具有相似的形態(tài)學(xué)、組織學(xué)及分子生物學(xué)特性[5]，但其主要問題是所需要的成瘤時間過長，成瘤率不能保證。

相對來說，移植瘤模型因其制作簡單、成瘤率穩(wěn)定及所需成瘤時間較短被各實驗室廣泛運(yùn)用。Pagets的種子和土壤學(xué)說[6]證實了腫瘤細(xì)胞的表型受到器官微環(huán)境的影響，皮下移植瘤模型轉(zhuǎn)移發(fā)生率較小，而且生存曲線的數(shù)據(jù)不準(zhǔn)確。因此，腫瘤的原位移植動物模型是目前較為理想而可靠的腫瘤模型。原位接種的方式又包括了支氣管內(nèi)注射和肺內(nèi)注射兩種方法，支氣管注射成瘤及瘤體大小、數(shù)目均不穩(wěn)定。有實驗室將A549細(xì)胞注入裸鼠肺內(nèi)，構(gòu)建移植人肺癌細(xì)胞的小鼠原位肺癌模型[7]，但在這一模型中裸鼠B細(xì)胞系統(tǒng)缺陷使小鼠體內(nèi)免疫反應(yīng)不能完全模擬人的免疫反應(yīng)，同時裸鼠的低免疫力容易導(dǎo)致裸鼠感染死亡，而在有免疫泄露的情況下，則可能導(dǎo)致成瘤率降低，這一切均可導(dǎo)致實驗誤差。況且裸鼠價格昂貴，進(jìn)行大規(guī)模的試驗性實驗往往造成不必要的浪費(fèi)。所以在新的治療方法的研究中，僅少數(shù)研究者采用了人肺癌的原位模型。

3LL細(xì)胞是小鼠Lewis肺癌，來源于C57小鼠，本研究選用3LL細(xì)胞對C57小鼠進(jìn)行接種，比較皮下接種及原位接種兩種造模方式。本研究發(fā)現(xiàn)若采用皮下接種方式，低劑量組成瘤率低（16.7%），成瘤時間長，約需2周-3周；高劑量組成瘤率雖能達(dá)到100%，但存在小鼠生存時間不一、轉(zhuǎn)移不穩(wěn)定的問題。而在原位接種組中，僅低劑量組1只小鼠未能成瘤，其原因考慮為接種時細(xì)胞有滲漏，導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)未達(dá)1×104，其余兩組小鼠成瘤率均為100%，大部分小鼠均有對側(cè)肺的轉(zhuǎn)移。通過血管轉(zhuǎn)移是肺癌的主要轉(zhuǎn)移方式之一，為證實原位接種組腫瘤具有較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力，本研究首先對兩組的微血管密度進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)腫瘤接種后第20天，原位接種組的微血管密度高于皮下接種組，這可能與原位接種部位血供充足，腫瘤組織生長迅速有關(guān)。其次，本研究對腫瘤細(xì)胞表面的CD44v分子進(jìn)行了檢測。CD44是表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞膜的單鏈糖蛋白，在IL-5、TNF-α、EGF等細(xì)胞因子活化下，通過HER-2、c-Src、Tiam 1以及RhoA等信號途徑[8]，可導(dǎo)致細(xì)胞遷移及不可控性的細(xì)胞增殖。CD44v是CD44的變異體，在腫瘤細(xì)胞的侵襲性生長及轉(zhuǎn)移中起著重要的作用。有研究[9]表明CD44v介導(dǎo)產(chǎn)生的粘附基質(zhì)對于腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移后的定居及生長至關(guān)重要，CD44v誘導(dǎo)的抗凋亡信號通路的活化支持轉(zhuǎn)移的形成，而且CD44v還可以將CD44v相關(guān)的MMP-9、MMP-2蛋白聚集在細(xì)胞膜，剪切TGF-β抑制相關(guān)蛋白，活化抑制的TGF-β，從而誘導(dǎo)血管形成[10]。因此，CD44v的表達(dá)與肺癌的轉(zhuǎn)移相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)腫瘤接種20 d后原位接種腫瘤CD44v的表達(dá)水平高于皮下接種組，這一結(jié)果具有兩方面的意義：一方面部分解釋了原位接種腫瘤具有較強(qiáng)轉(zhuǎn)移特性的可能原因；另一方面，這可能是原位接種組微血管密度較高的原因之一。當(dāng)然CD44v的表達(dá)受到多種細(xì)胞因子的調(diào)節(jié)[8]，在原位接種環(huán)境中表達(dá)上調(diào)的因素有待進(jìn)一步的研究。

在造模過程中，我們對原位接種法做了優(yōu)化，依照文獻(xiàn)使用了Matrigel，并對注射方法進(jìn)行了調(diào)整。Matrigel的特性使接種的腫瘤細(xì)胞能夠固定在注射部位，并成為腫瘤細(xì)胞生長的支架，使腫瘤形成單一病灶，便于觀察腫瘤的轉(zhuǎn)移。而注射以鹽水混懸的腫瘤細(xì)胞后，腫瘤細(xì)胞會因為重力作用而廣泛分散，導(dǎo)致腫瘤的多發(fā)病灶[12]。在我們的研究中，并不是所有小鼠均形成了單一病灶，預(yù)實驗中有的小鼠兩側(cè)肺臟布滿腫瘤結(jié)節(jié)，并與胸膜廣泛粘連，其原因在于Matrigel的凝固時間較長，如果將Matrigel與腫瘤細(xì)胞混勻后直接注射，Matrigel進(jìn)入肺臟之后不能立即凝固，必定產(chǎn)生腫瘤細(xì)胞在肺內(nèi)的擴(kuò)散，隨后我們改進(jìn)了方法，將Matrigel與腫瘤細(xì)胞混勻后，室溫孵育數(shù)分鐘，待混懸液顯得粘稠之后再將其注入小鼠肺臟，即可形成單一腫瘤病灶。然后，腫瘤在接種肺進(jìn)行性生長并且發(fā)生了相鄰部位、胸淋巴結(jié)及對側(cè)肺的轉(zhuǎn)移。肺癌的這種胸內(nèi)轉(zhuǎn)移模式與肺癌臨床患者的相似，表明這種模型具有很強(qiáng)的臨床相關(guān)性。但是，在這種模型中，缺乏臨床所顯現(xiàn)的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，這可能是因為肺部及胸廓的廣泛轉(zhuǎn)移導(dǎo)致了小鼠呼吸功能嚴(yán)重衰竭，在還未來得及出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的時候，小鼠因全身衰竭而死[13]。

綜上所述，以懸于Matrigel的3LL細(xì)胞對C57小鼠肺部原位接種以制備小鼠肺原位癌模型，較皮下接種模型具有更好的成瘤率及轉(zhuǎn)移特性。