TGF-beta1誘導(dǎo)人肺腺癌PC9細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究

張慧君 張雷 王和勇 陳曉峰

在惡性腫瘤中，肺癌仍是目前最常見的死亡原因。許多肺癌患者在就診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，據(jù)統(tǒng)計90%的肺癌患者死亡由轉(zhuǎn)移引起[1]，最近研究[2,3]表明上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。

EMT是指上皮細胞失去其上皮特征，獲得間質(zhì)特性的過程，它不僅參與胚胎形態(tài)的形成、心臟的發(fā)育和慢性退行性纖維化，而且促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[4]。此外，細胞外信號的生長因子如HGF、EGF、TGF-β、IGF、VEGF等可經(jīng)過不同的信號通道誘導(dǎo)細胞發(fā)生EMT，已證實PI3K/AKT信號通路參與EMT發(fā)生[5]。本文旨在研究TGF-β1誘導(dǎo)人肺腺癌PC9細胞發(fā)生EMT及對PI3K/AKT信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌PC9細胞為上海肺科醫(yī)院肺癌免疫研究室常規(guī)傳代培養(yǎng)；TGF-β1購自R&D公司；單克隆兔抗人E-cadherin、多克隆兔抗人AKT和單克隆小鼠抗人p-AKT均購自Cell Signaling Technology公司；單克隆小鼠抗人Fibronectin和Vimentin購自Santa Cruz公司；辣根酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG購自Abgent公司；F1TC標志的羊抗兔IgG購自Upstates公司；DMEM購自Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng) PC9細胞在37oC、5%CO2、飽和濕度條件下用含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL慶大霉素、低糖-DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。用0.25%胰酶消化傳代。細胞培養(yǎng)至融合70%-80%后，用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再加入TGF-β1處理48 h，按實驗要求分組。

1.3 細胞形態(tài)學(xué)觀察 將PC9細胞傳代于6孔板并用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，經(jīng)不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后在相差顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照。

1.4 Western blot檢測 不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理細胞48 h后，培養(yǎng)瓶中的貼壁細胞用4oC的PBS洗滌后轉(zhuǎn)移到EP管，12 000 rpm離心5 min，棄去上清，將收集到的細胞加入細胞裂解液裂解后，取上清液-20oC儲存。上樣，80 V電泳積聚蛋白，100 V電壓使蛋白分離并轉(zhuǎn)膜，5%脫脂牛奶封閉1 h。用單克隆兔抗人的E-cadherin（1:1 000）、單克隆小鼠抗人的Fibronectin和Vimentin（1:100）、多克隆兔抗人AKT和單克隆小鼠抗人p-AKT（1:500）分別與膜接觸4oC孵育過夜后，用TBST在脫色搖床下洗膜5 min×3次，在加辣根酶標記羊抗小鼠或抗兔IgG，室溫下孵育1 h后，用TBST洗膜5 min×3次，加入ECL化學(xué)發(fā)光顯示劑在室溫下反應(yīng)1 min后，用X光片曝光，然后定影、顯影。

1.5 細胞免疫熒光檢測 以每孔1×104個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中預(yù)置的載玻片上，細胞貼壁爬片，用無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，加入不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，取出載玻片，用0.4%多聚甲醛固定15 min，加入單克隆兔抗人的E-cadherin（1:200）、單克隆小鼠抗人Fibronectin和Vimentin（1:50）4oC過夜，加FITC標志的羊抗兔IgG和Cy3標志的羊抗小鼠IgG（1:50），37oC下孵育1 h，緩沖甘油封固，熒光顯微鏡下觀察并拍片。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1誘導(dǎo)PC9細胞形態(tài)學(xué)變化觀察 PC9細胞在不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，通過相差顯微鏡觀察，未處理的PC9細胞呈不典型上皮細胞形態(tài)，經(jīng)TGF-β1刺激后，大部分細胞形態(tài)明顯拉長，呈現(xiàn)明顯的間質(zhì)細胞形態(tài)，且5 ng/mL TGF-β1組比1 ng/mL組更為明顯。此外，細胞間連接也變得更疏松（圖1）。

2.2 TGF-β1對PC9細胞上皮及間質(zhì)標記蛋白表達的影響不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理PC9 細胞48 h后，Western blot顯示TGF-β1并不影響PC9細胞上皮標記蛋白E-cadherin和間質(zhì)標記蛋白Vimentin的表達。然而，間質(zhì)標記蛋白Fibronectin的表達量卻隨TGF-β1濃度的增加也相應(yīng)增加（圖2）。另外通過細胞免疫熒光也證實了Western blot的結(jié)果（圖3）。

2.3 TGF-β1對PI3K/AKT信號通路的影響 PC9細胞經(jīng)不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后，Western blot顯示P-AKT經(jīng)TGF-β1處理后其表達量降低，且1 ng/mL組和5 ng/mL組P-AKT表達量減少大致相仿（圖4）。

3 討論

腫瘤轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤進展的重要步驟，也是惡性腫瘤患者死亡的重要原因。因此研究腫瘤轉(zhuǎn)移的分子機制對抑制惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、提高腫瘤患者生存率至關(guān)重要。腫瘤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜的、多步驟的過程，首先腫瘤細胞脫離原發(fā)灶，通過血管生成和基底膜重建進入循環(huán)系統(tǒng)，但進入循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞必須克服循環(huán)系統(tǒng)的各種障礙才能到達轉(zhuǎn)移部位。腫瘤轉(zhuǎn)移涉及多種調(diào)控機制，其中促進腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要機制之一就是EMT[6,7]。

Greenburg等[8]指出培養(yǎng)中的上皮細胞可獲得間質(zhì)細胞特性，最早提出了EMT發(fā)生的證據(jù)。在胚胎形成、腫瘤發(fā)生發(fā)展及某些纖維化疾病的過程中，TGF-β作為EMT的主要誘導(dǎo)劑備受關(guān)注[9]。TGF-β1作為TGF-β家族的重要成員之一，在腫瘤發(fā)生發(fā)展及某些纖維化疾病過程中已被證實為EMT的主要誘導(dǎo)劑[10-13]。但是，對人肺腺癌PC9細胞來說，TGF-β1能否誘導(dǎo)PC9細胞發(fā)生EMT及對PI3K/AKT信號通路影響又如何？目前尚無相關(guān)報道。

圖 1 PC9細胞經(jīng)不同濃度（0 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL）TGF-β1處理48 h后的形態(tài)學(xué)變化Fig 1 Morphologic changes of PC9 cells induced by different concentrations (0 ng/mL, 1 ng/mL, 5 ng/mL) of TGF-β1 for 48 h

圖 2 Western blot檢測PC9細胞EMT相關(guān)標記蛋白Fibronectin表達變化Fig 2 The expression change of EMT related marker protein Fibronectin in PC9 cells was assessed by Western blot

圖 3 細胞免疫熒光檢測PC9細胞EMT相關(guān)標記蛋白Fibronectin表達變化Fig 3 The expression change of EMT related marker protein Fibronectin in PC9 cells was detected by immunoflurescence staining

圖 4 Western blot檢測TGF-β1對PC9細胞AKT和P-AKT的表達Fig 4 The expression of AKT and P-AKT in PC9 cells was assessed by Western blot

TGF-β1誘導(dǎo)PC9細胞發(fā)生EMT首先在細胞形態(tài)方面被證實[7]。Kasai等[11]指出肺腺癌A549細胞在TGF-β1作用下，由典型卵石狀的上皮表型轉(zhuǎn)化成纖維細胞樣的間質(zhì)表型，同時相鄰細胞間連接也變得疏松[11]。Yan等[14]用低氧處理肝癌細胞發(fā)生EMT，細胞誘導(dǎo)形態(tài)結(jié)果與Kasai 相似。本研究結(jié)果顯示未處理的PC9細胞呈不典型的上皮細胞形態(tài)，經(jīng)TGF-β1處理后大部分細胞形態(tài)較未處理組明顯拉長，相鄰細胞間連接也變得疏松。為了進一步證實經(jīng)TGF-β1處理的PC9細胞可發(fā)生EMT，我們首先用Western blot驗證EMT相關(guān)標記蛋白，結(jié)果顯示TGF-β1處理PC9細胞既沒有下調(diào)上皮標記蛋白E-cadherin的表達，也沒上調(diào)間質(zhì)標記蛋白Vimentin的表達，僅僅是上調(diào)了間質(zhì)標記蛋白Fibronectin的表達，細胞免疫熒光也證實了間質(zhì)標記蛋白Fibronectin表達上調(diào)。Shintani等[15]指出培養(yǎng)中的腫瘤細胞僅發(fā)生不完全EMT，從嚴格意義上講我們并不能觀察到真正的EMT[15]。Voulgari等[16]指出發(fā)生不完全EMT的腫瘤細胞，其分子標記物和細胞特征可發(fā)生不同程度的改變[16]。因此，在本研究中，TGF-β1可誘導(dǎo)肺腺癌PC9細胞發(fā)生EMT，且為不完全EMT。

TGF-β可通過酪氨酸激酶受體迅速激活PI3K/AKT信號通路[17,18]。PI3K激酶調(diào)節(jié)亞基已被證實與TβRI和TβRII受體相關(guān)，并可提高TGF-β的激活效果[19]。PI3K/AKT信號通路的阻斷可抑制TGF-β誘導(dǎo)的細胞形態(tài)學(xué)變化，并使a-SAM表達下調(diào)和E-cadherin表達上調(diào)[20,21]。由此可見，在EMT過程中，TGF-β在PI3K/AKT信號通路的激活中起重要作用。Chao等[22]指出經(jīng)TGF-β處理的腫瘤細胞的p-AKT表達量在4 h時達到高峰，之后其表達量逐漸減低。我們用TGF-β1處理PC9細胞48 h后p-AKT的表達量較未處理組明顯減少，而1 ng/mL組和5 ng/mL組的減少量并無差別，可推測PC9細胞在TGF-β1的刺激下，p-AKT的表達隨時間的變化而發(fā)生改變，但與TGF-β1濃度關(guān)系不大。

總而言之，TGF-β1可誘導(dǎo)肺腺癌PC9細胞發(fā)生不完全EMT，并影響PI3K/AKT信號通路。已證實PI3K/AKT信號通路參與胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移[23]，那么此通路對肺腺癌PC9細胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力又有何影響，還需進一步研究。