HPLC法測(cè)定蠶桑資源中1-脫氧野尻霉素的含量

陳巖，王智勇，楊一坤（.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，哈爾濱市5000；.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院藥學(xué)部，哈爾濱市 5000）

1-脫氧野尻霉素（1-deoxynojirimycin，DNJ）是天然存在的多羥基哌啶生物堿，化學(xué)名為（2R，3R，4R，5S）-2-（羥甲基）-3，4，5-三羥基哌啶。該化合物具有競(jìng)爭(zhēng)性抑制α-葡萄糖苷酶的藥理活性[1]，廣泛存在于蠶沙、桑白皮、桑枝、桑葉、桑椹等蠶桑資源中，可以防治餐后高血糖癥和緩解高胰島素血癥，同時(shí)可以提高糖耐量，預(yù)防和治療肥胖癥和高甘油三酯血癥，用于治療因碳水化合物代謝紊亂而引起的疾病。此外，還具有體外抗乙型肝炎病毒的作用[2，3]。

由于DNJ的結(jié)構(gòu)中缺少生色團(tuán)，無(wú)紫外吸收，目前多采用氣-質(zhì)聯(lián)用（GC-MS）、液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）、高效液相色譜-熒光檢測(cè)器（HPLC-FLD）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（HPLC-ELSD）法進(jìn)行含量測(cè)定[4～7]，對(duì)檢測(cè)儀器的要求高，給實(shí)際工作帶來(lái)不便。本試驗(yàn)參考有關(guān)文獻(xiàn)[4]進(jìn)行改進(jìn)，采用熒光試劑芴甲氧羰酰氯（FMOC-Cl）柱前衍生、高效液相色譜-紫外檢測(cè)器（HPLC-UV）測(cè)定蠶桑資源中DNJ的含量，國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)同類報(bào)道。

1 材料

1.1 儀器

HPLC儀，包括510泵、717自動(dòng)進(jìn)樣器、996二極管陣列檢測(cè)器、柱溫箱、Millennium 2010色譜工作站（美國(guó)Waters公司）；AG-245型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；H-26F型離心機(jī)（日本Kokusan公司）；XJD-B微型高速粉碎機(jī)（姜堰市銀河儀器廠）；N-1000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FD-5N型凍干機(jī)（日本Eyela公司）；KQ-200KDB型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；EK-120A型電子分析天平（日本A&D Co.，LTD公司）。

1.2 試藥

DNJ標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞99.2%）、熒光試劑FMOC-Cl均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；蠶沙、桑白皮、桑葉均購(gòu)自哈爾濱市老君堂藥店，經(jīng)沈陽(yáng)藥科大學(xué)孫啟時(shí)教授鑒定均為真品；甲醇、乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Hypersil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（50∶50）；檢測(cè)波長(zhǎng)：265 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：25 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，加水溶解并定容至10 mL，即得，備用。

2.2.2 藥材提取液：參考有關(guān)文獻(xiàn)[4]中藥材提取液的制備方法。精密稱取各藥材粉末1.0 g，加25 mL 0.05 mol·L-1HCl超聲波提取30 min，上清液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，殘?jiān)?0 mL 0.05 mol·L-1HCl超聲波提取30 min，合并上清液，加0.05 mol·L-1HCl定容，搖勻，得各藥材提取液，備用。

2.3 柱前衍生化處理

2.3.1 衍生化反應(yīng)原理[4]：20℃下，DNJ和過(guò)量的熒光試劑FMOC-Cl在pH 8.5的硼酸鹽緩沖液中反應(yīng)20 min，生成熒光產(chǎn)物DNJ-FMOC。

2.3.2 藥材供試液的制備：精密吸取各藥材提取液0.2 mL，置于1.5 mL離心管中，分別依次加入0.2 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.5）、0.1 mL 10 mmol·L-1FMOC-Cl的乙腈溶液，立即混勻，20℃反應(yīng)20 min，加入0.5 mL 0.1%冰醋酸水溶液，混勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，即得各藥材供試液。

2.3.3 空白供試液的制備：取重蒸水0.2 mL，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備空白供試液。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液5、10、25、50、100 μL，分別依次加入 0.2 mL硼酸鹽緩沖液（pH 8.5）、0.1 mL 10 mmol·L-1FMOC-Cl的乙腈溶液，立即混勻，20℃反應(yīng)20 min，加入0.1%冰醋酸水溶液補(bǔ)足至1.0 mL，混勻，0.45μm微孔濾膜濾過(guò)，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以DNJ濃度（X，mg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝47 800 312X－6 875（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，DNJ的檢測(cè)濃度在5.0×10-4～1.0×10-3mg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。檢測(cè)限為1.0×10-4mg·mL-1（P/N＞3）。

2.5 精密度試驗(yàn)

取衍生化的DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液（濃度為5.0×10-3mg·mL-1），按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。結(jié)果，RSD＝1.9%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取桑白皮藥材供試液，于配制后2、4、6、8 h進(jìn)樣，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定DNJ含量。結(jié)果，RSD＝1.8%，表明藥材供試液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取同一批桑白皮樣品，共6份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.9”項(xiàng)下方法操作。結(jié)果，RSD＝1.67%，表明方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱取已知含量的桑葉粉末0.5 g，共6份，分別精密加入DNJ標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取“2.3.2”項(xiàng)下各藥材供試液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定DNJ含量，結(jié)果見(jiàn)表2；色譜圖見(jiàn)圖1。

3 討論

通過(guò)二極管陣列檢測(cè)器得到DNJ-FMOC的最大吸收波長(zhǎng)為265 nm，因此確定檢測(cè)波長(zhǎng)為265 nm。在此波長(zhǎng)下，DNJ-FMOC的靈敏度高，所得色譜圖基線平穩(wěn)。

表2 蠶桑資源中DNJ的含量測(cè)定結(jié)果（n＝3）Tab 2Determination of DNJ in mulberry resources（n＝3）

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatogram

筆者考察了不同比例的乙腈-水、乙腈-0.1%冰醋酸水溶液為流動(dòng)相時(shí)DNJ-FMOC的分離效果，確定以乙腈-0.1%冰醋酸水溶液（50∶50）為流動(dòng)相進(jìn)行分析，DNJ-FMOC與衍生試劑FMOC-Cl及其它峰的分離度良好，峰形最佳。

DNJ無(wú)共軛體系，常用的檢測(cè)方法中HPLC-ELSD靈敏度低，HPLC-FLD存在熒光強(qiáng)度受外界因素（溫度、溶劑、pH值）影響大的問(wèn)題，而GC-MS、LC-MS使用成本高，不能在一般實(shí)驗(yàn)室普及。本試驗(yàn)采用柱前衍生、HPLC-UV檢測(cè)，方法具有對(duì)檢測(cè)儀器要求低、操作簡(jiǎn)單快速、衍生產(chǎn)物穩(wěn)定、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，可用于蠶桑資源中多羥基哌啶生物堿的定量分析，對(duì)蠶桑類中藥材的綜合質(zhì)量評(píng)價(jià)具有重要的意義。

[1]孫 蓮，孟 磊，閻 超.桑葉的降血糖活性成分和藥理作用[J].中草藥，2002，33（5）：471.

[2]孫 偉，李 靜，李婭娟.慢性肝炎治療藥物研究新進(jìn)展[J].中國(guó)藥房，2002，13（5）：29.

[3]彭忠田，申 璀，譚德明，等.脫氧野尻霉素衍生物抗乙型肝炎病毒的體外試驗(yàn)研究[J].中國(guó)藥房，2007，18（1）：9.

[4]Kim LW，Kim SU，Lee HS，et al.Determination of 1-deoxynojirimycin inMorus albaL.leaves by derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate followed by reversed-phase high-performance liquid chromatography[J].J Chromatogr A，2003，1 002（1）：93.

[5]耿 鵬，朱元元，楊 洋，等.桑樹(shù)資源中1-脫氧野尻霉素的測(cè)定及其生物活性成分分析[J].中草藥，2005，36（8）：1 151.

[6]姜永濤，陳繼永，劉 珂.HPLC-ELSD測(cè)定桑葉中1-脫氧野尻霉素的含量[J].藥物分析雜志，2005，25（1）：27.

[7]Toshiyuki K，Kiyotaka N，Yuko S，et al.Determination of 1-deoxynojirimycin in mulberry leaves using hydrophilic interaction chromatography with evaporative light scattering detection[J].J Agric Food Chem，2004，52：1 415.