HPLC法測定甲氧芐啶片主藥及有關(guān)物質(zhì)的含量

池秀珍（福建泉州市藥品檢驗所，泉州市 362000）

甲氧芐啶為一種廣譜、高效、低毒的抗菌增效劑[1]，其制劑甲氧芐啶片收載于《中國藥典》2005年版二部中。該標(biāo)準(zhǔn)[2]中含量測定采用紫外分光光度法，其原料藥項下有關(guān)物質(zhì)檢查采用薄層色譜法，但甲氧芐啶片項下未對有關(guān)物質(zhì)進(jìn)行控制。為了更全面的控制甲氧芐啶片的質(zhì)量，筆者建立了高效液相色譜（HPLC）法同時測定甲氧芐啶片中主藥及有關(guān)物質(zhì)的含量。結(jié)果表明，該法簡便、準(zhǔn)確，專屬性強(qiáng)，可用于甲氧芐啶片的含量測定及有關(guān)物質(zhì)的檢查。

1 儀器與試藥

1100系列HPLC儀、色譜工作站（美國Agilent公司）。

甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100031-200304，供含量測定用）；甲氧芐啶片（廣東臺城制藥有限公司，批號：20081001、20090402；江蘇永大藥業(yè)有限公司，批號：20060303。規(guī)格均為每片100 mg）；乙腈為色譜純，磷酸、三乙胺均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗

色譜柱：Waters symmetry C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.015 mol·L－1磷酸（用三乙胺調(diào)pH至3.5）-乙腈（83∶17)；流速：1 mL·min－1；柱溫：30 ℃；檢測波長：271 nm；進(jìn)樣量：10 μL。取“2.2”項下標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液與陰性對照溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果在上述色譜條件下，理論板數(shù)按甲氧芐啶計為11 053，陰性對照溶液不干擾測定。色譜見圖1。

2.2 溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖Fig 1 HPLC chromatography

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精密稱取甲氧芐啶標(biāo)準(zhǔn)品（105℃干燥3 h）20 mg置于25 mL容量瓶中，加0.01 mol·L－1HCl溶液適量，超聲使溶解，稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品貯備液。精密吸取貯備液5 mL，置于50 mL容量瓶中，用0.01 mol·L－1HCl溶液稀釋至刻度，搖勻。

2.2.2 供試品溶液與陰性對照溶液。取本品20片，精密稱定，研細(xì)，精密稱取適量（約相當(dāng)于甲氧芐啶80 mg）置于100 mL容量瓶中，加0.01 mol·L－1HCl溶液適量，超聲使溶解，并稀釋至刻度，搖勻，濾過。精密吸取續(xù)濾液5 mL，置于50 mL容量瓶中，加0.01 mol·L－1HCl溶液至刻度，搖勻，作為供試品溶液；另按處方比例稱取空白輔料適量，同法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

分別取本品細(xì)粉適量，分置于4個10 mL具塞試管中，1份加入0.01 mol·L－1HCl溶液10 mL搖勻后于4 500 Lx光照48 h；1份加3%H2O2溶液10 mL搖勻后于80℃水浴1 h；另2份分別加入1 mol·L－1HCl溶液10 mL、3 mol·L－1NaOH溶液10 mL于80℃水浴2 h。精密吸取各條件下破壞后的樣品溶液各1 mL，分置于10 mL容量瓶中（經(jīng)酸、堿破壞的樣品在稀釋前先中和），加0.01 mol·L－1HCl溶液至刻度，搖勻。取上述各溶液，照“2.1”項下的色譜條件，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜至主峰保留時間的4倍。結(jié)果，供試液在氧化破壞條件下產(chǎn)生的降解產(chǎn)物峰最多，其他破壞條件下也均有不同程度的降解產(chǎn)物產(chǎn)生。在此色譜條件下，甲氧芐啶與其相鄰降解產(chǎn)物峰都能達(dá)到有效分離，降解產(chǎn)物不干擾樣品的測定，色譜見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品貯備液0.2、0.6、1.0、1.4、2.0 mL分別置于10 mL容量瓶中，用0.01 mol·L－1HCl溶液稀釋至刻度，搖勻，得系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取上述溶液各10 μL注入色譜儀，照“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜。以標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（C）為橫坐標(biāo)，峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得線性方程為Y＝11.658 6C+4.298 7（r＝0.999 9，n＝5）。結(jié)果表明，甲氧芐啶檢測濃度線性范圍為16.1～161.3 μg·mL－1。

2.5 精密度試驗

取“2.4”項下標(biāo)準(zhǔn)品溶液（80 μg·mL－1），連續(xù)進(jìn)樣5次，測定峰面積，結(jié)果峰面積的RSD＝0.1%。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一批樣品（20081001）6份，照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件試驗，測得其平均含量為99.6%，RSD＝0.3%。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.6”項下的供試品溶液，室溫放置，分別于0、2、4、8、12、24 h時進(jìn)樣10 μL，結(jié)果其峰面積的RSD＝0.5%。表明供試品溶液在室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

取已知含量的樣品9份，按高、中、低濃度加入不同量的標(biāo)準(zhǔn)品各3份，照“2.1”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

2.9 最低檢測限與定量限

取標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋、測定，按信噪比（S/N）為3∶1，測得最低檢測限為3.8 ng；按信噪比（S/N）為10∶1，測得定量限為13.9 ng。

2.10 樣品中主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測定

取不同生產(chǎn)廠家的樣品3批，按“2.2”項下方法制備供試品溶液、標(biāo)準(zhǔn)品溶液，照“2.1”項下色譜條件測定，記錄色譜，按外標(biāo)法以峰面積計算含量，并與《中國藥典》記載的紫外分光光度法測定結(jié)果進(jìn)行比較。

精密稱取本品細(xì)粉適量，用0.01 mol·L－1HCl溶液制成每1 mL含0.8 mg的溶液，濾過，取續(xù)濾液作為供試液；精密吸取供試液1 mL，用0.01 mol·L－1HCl溶液制成每1 mL含0.008 mg的溶液作為對照溶液。取對照溶液10 μL，注入色譜儀，調(diào)節(jié)儀器檢測靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的20%～25%，再精密吸取供試液與對照溶液各10 μL，分別注入色譜儀，記錄色譜至主成分峰保留時間的2倍，供試液如有雜質(zhì)峰，按主成分自身對照法計算雜質(zhì)總量，各雜質(zhì)峰面積的和不得大于對照溶液主峰面積(1.0%)。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab 1 Result of recovery test（n＝9）

主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果見表2。

表2 樣品中主藥及有關(guān)物質(zhì)含量測定結(jié)果（%%）Tab 2 Content determination of trimethoprim and its related substances（%%）

由表2可見，本文建立的主藥含量測定方法與藥典法比較結(jié)果無差異。

3 討論

筆者參考了相關(guān)文獻(xiàn)[3～5]，比較了不同比例、不同pH的乙腈-磷酸溶液以及甲醇-0.1 mol·L－1磷酸二氫鉀溶液作為流動相系統(tǒng)時的分離效果。結(jié)果以0.015 mol·L－1磷酸（用三乙胺調(diào)pH至3.5）-乙腈（83∶17）為流動相時，甲氧芐啶色譜峰峰形最好，保留時間適中（5.7 min），主峰與其相鄰的雜質(zhì)峰能有效分離，溶劑、輔料均不干擾測定。

[1]張 倫.甲氧芐啶的應(yīng)用、生產(chǎn)和市場狀況[J].中國藥房，2001，12（3）：143.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典（二部）[S].2005年版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：118.

[3]國家藥典委員會編.國家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品[S].第十三冊.2002，12：108.

[4]韓志云，朱迎春.HPLC法測定頭孢氨芐甲氧芐啶膠囊含量的方法改進(jìn)[J].海峽藥學(xué)，2007，19（1）：48.

[5]謝 燕，陳 明，肖艷萍.高效液相色譜法測定甲氧芐啶氯化鈉注射液中甲氧芐啶的含量[J].精細(xì)化工中間體，2006，36（4）：63.