框鏡鯉致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定

龔 倩，高淑琴，單曉楓，郭偉生，孟慶峰，王偉利*，錢愛東*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學動物科學技術學院，吉林長春130118；2.吉林省東遼縣衛(wèi)生學校，吉林東遼136600；3.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林長春130062)

框鏡鯉(Cyprinus carpio)是以德國鏡鯉為親本，人工選育的優(yōu)良魚種，為吉林省淡水魚養(yǎng)殖的一個重要品種。但其抗逆性差，對病原易感性強[1]。2008年6月～7月間，吉林省某養(yǎng)殖戶養(yǎng)殖的框鏡鯉出現(xiàn)大量死亡，病魚主要表現(xiàn)為肛門紅腫，體表局部出現(xiàn)紅點，剖檢可見主要臟器有出血點，消化道粘膜出血。由瀕死魚體內(nèi)分離一株致病性病原菌，經(jīng)生理生化試驗，16S rRNA序列分析，鑒定該菌株為維氏氣單胞菌(Aeromonas veronii)，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料和方法

1.1 病料樣品來源 病魚采自吉林省某框鏡鯉養(yǎng)殖場瀕死魚；健康框鏡鯉由吉林省某養(yǎng)殖場提供，體質量為100g左右。

1.2 主要試劑 RS瓊脂、細菌微量生化反應管購自北京陸橋技術有限責任公司；Prem in-Taq和DNA Marker(DL2000)購自TaKaRa公司；藥敏紙片購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 病原菌的分離 取發(fā)病癥狀典型的框鏡鯉，采集肌肉、心血、肝臟、胰臟等組織樣品，劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板和RS瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，挑取形態(tài)一致的優(yōu)勢菌群進行純培養(yǎng)。

1.4 動物回歸試驗 將分離菌株接種于營養(yǎng)瓊脂斜面28℃培養(yǎng)24h，用PBS稀釋成1.98×108cfu/m L的菌懸液，以每尾0.2m L的劑量腹腔注射接種健康框鏡鯉，對照組注射0.2m L PBS，每組各注射8尾，飼養(yǎng)水溫保持22℃左右。持續(xù)觀察7d，同時對病死魚進行病原菌的分離，并觀察和鑒定其形態(tài)及理化特性。

另外，采集自然發(fā)病癥狀典型的瀕死魚組織臟器，添加無菌PBS(比例1g∶5m L)進行研磨，反復凍融。10000r/min離心，上清用0.22μm濾膜過濾，濾液接種健康魚，方法同上。

1.5 病原菌的鑒定

1.5.1菌體形態(tài)與菌落形態(tài)觀察將純培養(yǎng)的菌劃線接種于RS瓊脂平板和營養(yǎng)瓊脂平板，28℃培養(yǎng)24h，觀察菌落形態(tài)；挑取單個菌落做革蘭氏染色，觀察菌體形態(tài)。

1.5.2主要生化性狀測定參照微量生化反應管說明書鑒定分離菌純培養(yǎng)物。

1.5.316S rRNA基因序列分析挑取單個菌落于滅菌水中，99℃10min變性后4℃12000r/min離心5min，取上清作為模板，進行PCR擴增。引物為細菌16S rRNA通用引物：上游引物AGAGTTTG ATCCTGGCTCAG，下游引物ACGGTTACCTTGTT ACGACTTC。反應條件：94℃5min；94℃1min、55℃ 1m in、72℃ 1.5m in，30個循環(huán)；72℃5m in。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測并回收純化。引物合成和測序由TaKaRa公司完成。

測序結果通過NCBI的BLAST檢索系統(tǒng)進行序列相似性比較，并使用DNAStar軟件進行分析，與GenBank中登錄的細菌株序列進行比較，構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 藥敏試驗 將分離菌菌稀釋成5×106cfu/m L濃度，取0.1m L該濃度菌液均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板上，干燥后貼上藥敏紙片，30℃培養(yǎng)24h，觀察抑菌圈并測量抑菌圈直徑。

2 結果與討論

2.1 病原菌的分離與動物回歸試驗 由自然感染的瀕死魚體內(nèi)分離一株優(yōu)勢菌株，命名為CY0806，經(jīng)動物回歸試驗，腹腔接種框鏡鯉，在5d內(nèi)全部死亡，對照組無異常表明該細菌株具有較強的致病性。剖檢病死魚，病理變化與自然病死魚相同，并且從中也分離出與CY0806菌體形態(tài)和理化特性相同的細菌。而將組織濾液接種鯉魚，并未出現(xiàn)發(fā)病死亡現(xiàn)象，因此該框鏡鯉死亡的病因為細菌感染所致，而非病毒感染。

2.2 病原菌的鑒定 經(jīng)28℃培養(yǎng)24h，細菌株CY0806在營養(yǎng)瓊脂上生長的菌落呈圓形、表面光滑濕潤、邊緣整齊、白色、不透明；而在RS瓊脂上菌落呈圓形、光滑濕潤、扁平、黃色、菌落邊緣略顯粗糙、刮去菌落留下黃色菌落痕跡。鏡檢為革蘭氏陰性桿菌。

依據(jù)CY0806菌體形態(tài)和理化特性檢測結果(表1)，參照伯杰氏鑒定細菌學手冊、魚類和其他水生生物細菌實用鑒定手冊，初步判定CY0806為A.veronii。

表1 分離菌的理化特性Table 1Physical and biochem ical properties of the isolated bacteria

以細菌株CY0806的DNA為模板，通過16S rRNA通用引物，擴增出長度約1500bp的片段(圖1)，測序結果顯示克隆片段長1458bp。將其基因序列用BLAST進行同源性比較，依據(jù)同源性檢索結果，選取不同氣單胞菌種屬的代表株構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示其與維氏氣單胞菌16S rRNA基因序列相似性為100%(圖2)，因而從分子水平上進一步證實細菌株CY0806為A.veronii。

A.veronii在人機體抵抗力下降時，可引發(fā)壞死性腦膜炎、敗血癥、腹瀉等疾病[2-4]。此外，該菌還可引發(fā)魚類病害：在國外有報道該菌曾引發(fā)孟加拉國魚類流行性潰瘍綜合征[5]；在國內(nèi)，研究者也陸續(xù)從中華絨螯蟹、青蝦、泥鰍和西伯利亞鱘等體內(nèi)分離出致病性A.veronii[6-9]。因此，A.veronii是一種人-獸-魚共患病原菌。本研究在國內(nèi)首次從框鏡鯉體內(nèi)分離一株致病性A.veronii。該菌株經(jīng)動物回歸試驗，顯示其對框鏡鯉具有較強的致病性，但對其他水生生物和哺乳動物是否具有致病性，還需進一步試驗研究。

本實驗在病原菌的分離鑒定時，采取選擇性培養(yǎng)基、理化特性、16S rRNA序列分析等相結合的方法，快速得到病原菌，在鑒定時幾種方法相互驗證，使鑒定結果更可靠，最終確定CY0806為A.veronii。

2.3 藥敏試驗 菌株CY0806經(jīng)對20種藥物的敏感性試驗，結果表明：該細菌株對慶大霉素、諾氟沙星、環(huán)丙沙星、氧氟沙星、呋喃唑酮、頭孢噻吩、氯霉素、紅霉素、阿奇霉素、新霉素和氟哌酸等11種藥物高度敏感，抑菌圈直徑為20mm～40mm；對卡那霉素、復方新諾明、呋喃妥因、多粘菌素B、磷霉素和鏈霉素等6種藥物中度敏感，抑菌圈直徑為10mm～19mm；對四環(huán)素、新生霉素和青霉素G等3種藥物耐藥，抑菌圈直徑為0mm～9mm。該結果與潘曉藝等[7]和馬志宏等[9]所報道結果不盡相同，這可能與細菌株的來源和區(qū)域分布不同有關；此外，試驗結果在藥物防治框鏡鯉A.veronii感染時合理選擇用藥，以及耐藥規(guī)律的研究提供實驗依據(jù)。

[1]宮會頂，王武民，張卓.池塘養(yǎng)殖鏡鯉主要病害的治療及綜合防治措施[J].中國水產(chǎn)，2008(9)：67-68.

[2]Grbner S,Bissinger A L,Raible A,et al.Severe diarrhea caused by Aeromonas veronii biovar sobria in a patient w ith metastasised GIST[J].Pol JM icrobiol,2007,56(4):277-279.

[3]Cui H,Hao S,Arous E.A distinct cause of necrotizing fasciitis:Aeromonas veronii biovar sobria[J].Surg Infec,2007,8(5):523-528.

[4]Shiina Y,Ii K,Iwanaga M.An Aeromonas veronii biovar sobria infection with disseminated intravascular gas production[J].J infec chemot therapy,2004,10(1):37-41.

[5]Rahman M,Colque-Navarro P,K hn I,et al.Identification and characterization of pathogenic Aeromonas veronii biovar sobria associated w ith epizootic ulcerative syndrome in fish in Bangladesh[J].Appl Environ M icrobiol,2002,68(2):650-655.

[6]房海，陳翠珍，張曉君，等.中華絨螯蟹病原維氏氣單胞菌的檢驗[J].中國人獸共患病學報，2008，24(1)：45-49.

[7]潘曉藝，沈錦玉，李建應，等.青蝦“軟殼綜合癥”病原及其特性[J].微生物學通報，2009，36(10)：1571-1576.

[8]秦蕾，徐靜，張曉軍.泥鰍的凡隆氣單胞菌感染[J].中國人獸共患病學報，2008，24(12)：1100-1102.

[9]馬志宏，楊慧，李鐵梁，等.西伯利亞鱘致病性維氏氣單胞菌的分離鑒定[J].微生物學報，2009，49(10)：1289-1294.