豬源耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的耐藥性及其SCCm ec基因分型研究

王 新，黃 山，周 婷，劉俊寧，楊保偉，席美麗，申進(jìn)玲，只 帥，孟江洪

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)食品學(xué)院，陜西楊凌 712100；2.四川省石棉縣畜牧局，四川石棉625400；3.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西楊凌71210)

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)是導(dǎo)致醫(yī)院或社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一[1]。MRSA不但對甲氧西林耐藥，而且對臨床使用的多種抗生素呈交叉耐藥和多重耐藥，是臨床抗感染治療的難題之一。MRSA耐甲氧西林主要是獲得了外源性mecA基因，該基因編碼青霉素結(jié)合蛋白2a，造成對β酰胺類藥物耐藥。mec基因位于金黃色葡萄球菌(SA)染色體基因盒(Staphylococcal cassette chromosome mec，SCCmec)上，該元件還攜帶了除mecA基因外的其他抗生素耐藥基因，這是造成多重耐藥的重要分子基礎(chǔ)[2-4]。醫(yī)院感染MRSA基因型多為SCCmecⅠ、Ⅱ、Ⅲ型，具有多重耐藥特點(diǎn)，除攜帶mecA基因外還帶有其他耐藥基因；而社區(qū)獲得性的MRSA菌株基因型多為Ⅳ型和Ⅴ型，SCCmec-Ⅳ型又分為a、b、c、d 4個(gè)亞型，SCCmecⅣ和Ⅴ型基因盒較短，除了攜帶mecA基因外幾乎不帶有其他耐藥基因，具有對非β-內(nèi)酰胺類的抗菌藥物敏感特點(diǎn)，提示SCCmec基因分型可以區(qū)分醫(yī)院和社區(qū)感染的MRSA[2,5]。最近報(bào)道了MRSA在豬和人之間傳播，所以豬源MRSA引起了全世界的廣泛的關(guān)注[1,6]。本研究通過調(diào)查陜西豬場MRSA的流行情況、耐藥譜特征及其SCCmec基因分型，初步了解陜西豬群中MRSA的耐藥特點(diǎn)及分子流行病學(xué)特征，為生豬及其產(chǎn)品安全風(fēng)險(xiǎn)評估提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 樣品及標(biāo)準(zhǔn)菌株來源 從2009年1月～7月，采集陜西省6個(gè)規(guī)?；i場的鼻腔拭子共計(jì)173份；質(zhì)控菌株SA ATCC29213，大腸埃希菌ATCC25922來源于本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 主要試劑 Baird-Parker瓊脂培養(yǎng)基，胰酶大豆肉湯/瓊脂，購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；萬古霉素(VAN)，四環(huán)素(TET)，環(huán)丙沙星(CIP)，慶大霉素(GEN)，紅霉素(ERY)，苯唑西林(OXA)，頭孢西丁(FOX)，氯霉素(CHL)，甲氧芐啶(TMP)，阿米卡星(AMK)，頭孢哌酮(CFP)等11種抗生素均購自Sigma公司；dNTPs、Taq DNA聚合酶及100bp Marker，均購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.3 SA及MRSA分離及鑒定 將采集的豬鼻腔拭子浸出液接種于含7.5%NaCl TSB肉湯中，37℃培養(yǎng)24h，接種到Baird-Parker Agar平板中，37℃培養(yǎng)24h，每個(gè)可疑樣品挑取2個(gè)菌落，進(jìn)行純化培養(yǎng)。nuc基因和mecA基因參照文獻(xiàn)[7]進(jìn)行二重PCR反應(yīng)，PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，鑒定出SA或MRSA。

1.4 PCR擴(kuò)增引物 二重PCR引物參照文獻(xiàn)[7]，確定SA或MRSA。多重PCR分型引物參照文獻(xiàn)[2]的方法確定SCCmec基因型，引物由寶生物工程(大連)有限公司合成(表1)。

表1 HBF-1分離株的發(fā)病規(guī)律Table 1Disease regulation of HBF-1in fox

1.5 DNA的提取 挑取純培養(yǎng)細(xì)菌加入500μL雙蒸水的1.5m L離心管中，混勻。煮沸20m in，12000r/m in離心5m in，取上清液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 SCCmec基因分型檢測 SCCmec基因分型采用多重PCR，引物、反應(yīng)條件參照文獻(xiàn)[6]。

1.7 MRSA耐藥性檢測 參照CLSI[8]指導(dǎo)說明進(jìn)行瓊脂平板稀釋法測定菌株抗生素敏感性試驗(yàn)。OXA最低抑菌濃度(M IC)≥4μg/m L為 MRSA，≤2μg/m L為甲氧西林敏感SA(MSSA)。FOX最低抑菌濃度(M IC)≥6μg/m L為MRSA，≤4μg/m L為MSSA[9]。

2 結(jié)果與討論

2.1 分離鑒定SA及MRSA 173份豬鼻腔拭子通過選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)和PCR鑒定定出83株SA，其中14株(13株對OXA耐藥和1株對OXA敏感)為MRSA；6個(gè)豬場中有2個(gè)豬場分離到MRSA，然而在豬群中的感染率為8.1%(14/173)，與其他地區(qū)監(jiān)測的豬群感染結(jié)果(24.9%)比較[10]，發(fā)生率較低，但值得注意的是14株MRSA菌株都來自兩個(gè)規(guī)?；i場，在這兩個(gè)豬場分離的SA均為MRSA菌株，這可能與各個(gè)豬場用藥方式不同，產(chǎn)生耐藥的不均一性有關(guān)(表2)。

對分離的83株SA，采用OXA和FOX進(jìn)行MRSA鑒定，分別確定出 13株和 14株 MRSA，F(xiàn)OX瓊脂稀釋法與PCR檢測結(jié)果一致(表2)，這與Swenson等報(bào)道使用FOX優(yōu)于使用OXA鑒定MRSA一致[9,11]。

表2 陜西地區(qū)豬場SA及MRSA的測結(jié)果Table 2Prevalence of isolates of SA and MRSA from 6large-scale sw ine farms in Shaanxi province

2.2 MRSA SCCm ec基因分型及抗菌藥物耐藥性豬源MRSA對11種常見抗生素耐藥性，表現(xiàn)出多重耐藥的特點(diǎn)，除對CFP、CHL、AMK和VAN敏感外，對CIP、OXA耐藥率分別為57.1%和92.9%；對FOX、TET、ERY、甲氧嘧啶和GEN的耐藥率都為100%。14株MRSA的SCCmec基因型均為SCCmecⅣb型，尚未發(fā)現(xiàn)其它SCCmec基因型，表明本地區(qū)豬場可能主要流行SCCmecⅣb型MRSA株，并具有多重耐藥特點(diǎn)(表3)。與徐等報(bào)道的人源SCCmecⅣ型MRSA菌株藥物敏感性存在較大差異[6,13]，揭示我們不能單獨(dú)采用SCCmec基因型解釋其耐藥性的特點(diǎn)[2,5]，表明本地區(qū)豬源MRSA可能存在其它耐藥機(jī)制，還將有待進(jìn)一步研究證明，這一結(jié)果提示著公共衛(wèi)生和人類健康又將面臨新的挑戰(zhàn)，應(yīng)警惕豬源MRSA通過豬及其產(chǎn)品感染人。

表3 MRSA菌株對11種抗生素的耐藥譜Table 3Percentages of 14MRSA isolates resistant to antibiotics

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