豬瘟活疫苗(種毒)鑒別檢驗(yàn)陽(yáng)性血清制備

戴志紅，關(guān)孚時(shí)，蔣 卉，孫海燕，李 翠，趙丹彤，關(guān)永梅，石寶蘭，張慧芳，張瑞婷，張立春，鄧 永，江 波，孟畫(huà)詩(shī)，王在時(shí)*

(1.中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京100081；2.金宇保靈生物藥品有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特010030)

豬瘟(Classical sw ine fever，CSF)是由CSF病毒(CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性豬傳染病，給世界上很多國(guó)家和地區(qū)帶來(lái)了嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織將其列為法定通報(bào)性疫病，我國(guó)將其列為一類動(dòng)物傳染病。

我國(guó)目前實(shí)行強(qiáng)制免疫作為豬瘟防制的主要手段，因此保證疫苗質(zhì)量顯得尤為重要。鑒別檢驗(yàn)是動(dòng)物活疫苗質(zhì)量檢驗(yàn)的重點(diǎn)之一，其目的是保證疫苗(菌毒種)的特異性，豬瘟兔化弱毒活疫苗也不例外?！吨腥A人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程》(2000年版)[1]和《中華人民共和國(guó)獸藥典》(2005年版3部)[2]都要求對(duì)豬瘟活疫苗(包括種毒)進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)，但由于鑒別檢驗(yàn)用陽(yáng)性血清缺乏，該工作實(shí)際并未進(jìn)行，給疫苗質(zhì)量監(jiān)管留下了隱患。為解決生產(chǎn)、檢驗(yàn)需要，本實(shí)驗(yàn)制備了豬瘟活疫苗(種毒)鑒別檢驗(yàn)陽(yáng)性血清，并進(jìn)行了驗(yàn)證試驗(yàn)。

1 材料和方法

1.1 種毒和細(xì)胞 CSFV石門(mén)株(F114)、豬瘟兔化弱毒種毒(F480)、CSFV Thiverval株(F18)和 PK-15細(xì)胞(F145)由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所鑒定、保存。

1.2 主要試劑 豬瘟活疫苗(淋脾毒)，由乾元浩生物股份公司提供；豬瘟ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Idexx公司；豬瘟熒光抗體由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備；Taq DNA聚合酶、dNTPs、RNasin和 RNase Free Water均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物公司；RNA提取試劑TRIzol Reagent和反轉(zhuǎn)錄酶SSⅢ均購(gòu)自Invitrogen公司；MEM培養(yǎng)基、胎牛血清和胰酶均購(gòu)自Gibico BRL公司；48孔細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)自CoStar公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 實(shí)驗(yàn)豬為普通健康非免疫豬，體質(zhì)量20kg左右，購(gòu)于內(nèi)蒙某豬場(chǎng)，經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測(cè)為口蹄疫、豬偽狂犬病、豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬細(xì)小病毒病、牛病毒性腹瀉/粘膜病病原、抗體陰性(病原用PCR或RT-PCR方法檢測(cè)，抗體用ELISA方法檢測(cè))，隔離飼養(yǎng)；體質(zhì)量18g～22g小白鼠、體質(zhì)量1.5kg～2kg日本大耳白兔、體質(zhì)量350g～400g豚鼠，均為清潔級(jí)，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。

1.4 免疫原制備 按文獻(xiàn)方法[1]在強(qiáng)毒隔離動(dòng)物室制備免疫原，共獲得CSFV石門(mén)株血毒4000m L(≥105MLD/m L)，-20℃以下凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 血清制備 在強(qiáng)毒隔離動(dòng)物室制備血清。選4頭豬，每頭豬免疫豬瘟活疫苗2頭份；14d后每頭豬肌肉注射免疫原100m L；以后每頭豬每隔10d肌肉或腹腔注射免疫原200m L～300m L，同時(shí)進(jìn)行ELISA抗體水平監(jiān)測(cè)，直至抗體效價(jià)接近峰值時(shí)分別采血，分離血清。

1.6 血清過(guò)濾、分裝、凍干、熔封 將4批血清分別先經(jīng)0.4μm無(wú)菌濾膜加壓過(guò)濾，再經(jīng)0.22μm無(wú)菌濾膜加壓過(guò)濾；隨后用瓶頸分液器(分裝精度為±0.01m L)無(wú)菌分裝至1m L滅菌長(zhǎng)安瓿，分裝過(guò)程中用攪拌子保持低速攪拌；按常規(guī)方法凍干后抽真空、熔封。

1.7 成品檢驗(yàn)

1.7.1物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度測(cè)定4批產(chǎn)品均隨機(jī)抽取規(guī)定數(shù)量的樣品，按文獻(xiàn)方法[1]和[2]進(jìn)行。

1.7.2剩余水分測(cè)定采用真空干燥法[1]。

1.7.3均一性檢驗(yàn)每批隨機(jī)抽取20支樣品，隨機(jī)分為2組，分別進(jìn)行稱重試驗(yàn)。將每支安瓿稱重后，分別仔細(xì)收集玻璃殘?jiān)?；將安瓿?nèi)容物溶解后用去離子水沖洗干凈，烘干，連同各自的玻璃殘?jiān)謩e稱重；再用安瓿打開(kāi)前的總重量減去該重量，即可計(jì)算凍干血清的重量。用狄克遜準(zhǔn)則剔除數(shù)據(jù)中的異常值[3]，再進(jìn)行t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)[3-4]，即用t檢驗(yàn)法檢驗(yàn)兩組測(cè)定結(jié)果的平均值是否存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，用F檢驗(yàn)法檢驗(yàn)兩組測(cè)定結(jié)果的方差是否存在顯著性差異。若兩組測(cè)定結(jié)果的均值和方差無(wú)顯著差異，則被測(cè)樣品均一性符合要求。

1.7.4特異性檢測(cè)每批隨機(jī)抽取5支樣品，同一批次復(fù)溶混合后委托農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心進(jìn)行口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病毒抗體檢測(cè)(均用ELISA方法進(jìn)行)。

1.7.5殘余CSFV檢測(cè)每批隨機(jī)抽取5支樣品，同一批次復(fù)溶混合后按文獻(xiàn)[5]和[6]的分別進(jìn)行免疫熒光和套式RT-PCR檢測(cè)，以CSFV Thiverval株作陽(yáng)性對(duì)照，以PBS作陰性對(duì)照。

1.7.6兔體中和效價(jià)測(cè)定將4批血清分別按照1∶400～1∶3200倍比稀釋。將豬瘟兔化弱毒種毒用滅菌生理鹽水稀釋至100兔體感染量(Rabbit infection dose，RID)/m L，與等量的稀釋血清充分混合，置10℃～15℃中和1h，其間振搖2次～3次；同時(shí)設(shè)立種毒陽(yáng)性對(duì)照(50RID/m L)、陰性對(duì)照(4批血清的所有稀釋度） 和空白對(duì)照(生理鹽水)。中和結(jié)束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1m L。按文獻(xiàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)[1-2]測(cè)溫。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)熱反應(yīng)，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)熱反應(yīng)，則試驗(yàn)成立。以中和后完全不引起熱反應(yīng)的血清最高稀釋度作為該血清的中和效價(jià)。

1.8 鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn) 將5種經(jīng)效力檢驗(yàn)合格的豬瘟活疫苗和豬瘟兔化弱毒種毒分別用滅菌生理鹽水稀釋至100RID/m L，與等量按各自中和效價(jià)稀釋的4批血清充分混合，置10℃～15℃中和1h，其間振搖2次～3次；同時(shí)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照(50RID/m L種毒和疫苗)、陰性對(duì)照(按中和效價(jià)稀釋的血清)和空白對(duì)照(生理鹽水)。中和結(jié)束后，分別接種大耳白兔2只，每只耳緣靜脈接種1m L。按文獻(xiàn)方法和標(biāo)準(zhǔn)[1-2]測(cè)溫。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)熱反應(yīng)，而陰性對(duì)照和空白對(duì)照不出現(xiàn)熱反應(yīng)，則試驗(yàn)成立。按實(shí)際中和結(jié)果驗(yàn)證各批次血清的鑒別檢驗(yàn)效果。

2 結(jié)果

2.1 物理性狀、無(wú)菌檢驗(yàn)、安全檢驗(yàn)、支原體檢驗(yàn)、真空度測(cè)定 結(jié)果均符合規(guī)定。

2.2 剩余水分測(cè)定 采用真空干燥法對(duì)抽取樣品進(jìn)行了剩余水分測(cè)定，結(jié)果水分含量均低于4%(表1)。

表1 凍干血清剩余水分含量(%)Table 1The residualmoisture contents of lyophilized antisera(%)

2.3 均一性檢驗(yàn) 對(duì)4批樣品(每批2組)的稱重結(jié)果進(jìn)行了經(jīng)t檢驗(yàn)和F檢驗(yàn)，結(jié)果所有統(tǒng)計(jì)量t和F均小于其臨界值(表2)，表明每個(gè)批次內(nèi)兩組測(cè)定結(jié)果的平均值和方差無(wú)顯著性差異，說(shuō)明4批血清樣品的均勻性良好。

2.4 特異性檢驗(yàn) 4批樣品經(jīng)農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)診斷中心檢測(cè)，結(jié)果口蹄疫病毒、豬偽狂犬病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬細(xì)小病毒、牛病毒性腹瀉/粘膜病病毒ELISA抗體均為陰性。

2.5 殘余CSFV檢測(cè) 將樣品復(fù)溶后分別接種PK-15細(xì)胞，再進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果均為陰性(圖略)；將樣品復(fù)溶后進(jìn)行套式RT-PCR核算檢測(cè)，結(jié)果均為陰性(圖1)。

2.6 兔體中和效價(jià)測(cè)定 4批血清倍比稀釋后分別與豬瘟兔化弱毒種毒中和，測(cè)定兔體中和效價(jià)(表3)。

表2 均一性測(cè)定結(jié)果Table 2The results of uniform ity tests

表34 批血清的兔體中和效價(jià)Table 3The neutralization titers of 4antisera tested in rabbits

2.7 鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn) 將4批血清分別按各自中和效價(jià)稀釋后，與100RID/m L的CSFV種毒和5種CSF疫苗中和后分別注射大耳白兔，進(jìn)行鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)。結(jié)果顯示，4批產(chǎn)品中和種毒和疫苗后，均不引起家兔產(chǎn)生熱反應(yīng)和其他異常反應(yīng)(表4)，表明該4批血清能特異性中和豬瘟疫苗和種毒，可以用于其鑒別檢驗(yàn)。

3 討 論

鑒別檢驗(yàn)是活疫苗(包括其生產(chǎn)用菌毒種)的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目之一，其目的是保證疫苗(菌毒種)的特異性，即檢驗(yàn)疫苗(菌毒種)是否具備其應(yīng)有的免疫學(xué)或生物學(xué)特性。病毒類活疫苗(種毒)鑒別檢驗(yàn)常用的方法是檢驗(yàn)活疫苗(種毒)是否能被已知的單特異性抗體完全中和。由此可見(jiàn)，鑒別檢驗(yàn)的目的和方法有別于外源病毒檢驗(yàn)或效力檢驗(yàn)，其重要性不容忽視。

表4 對(duì)種毒和5種豬瘟疫苗鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果Table 4Verification of identity tests to seed virus and 5CSF vaccines

為提高血清質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采取了以下措施：對(duì)實(shí)驗(yàn)豬和制備的血清進(jìn)行了常見(jiàn)病原、抗體檢測(cè)，保證了血清的特異性；在采血前，對(duì)抗體水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，盡量提高血清效價(jià)；在分裝前進(jìn)行了2次過(guò)濾，在分裝過(guò)程中保持低速混勻，并且進(jìn)行了均一性檢驗(yàn)，保證了每批樣品的均一性；以免疫熒光和套式RT-PCR方法對(duì)血清進(jìn)行了殘余CSFV檢測(cè)，提高了其生物安全性；用豬瘟兔化弱毒種毒和不同廠家生產(chǎn)的5種疫苗進(jìn)行了鑒別檢驗(yàn)驗(yàn)證試驗(yàn)，保證了血清的實(shí)際使用效果。

在過(guò)程中實(shí)驗(yàn)豬經(jīng)強(qiáng)毒反復(fù)攻擊，因此該血清存在殘余強(qiáng)毒的風(fēng)險(xiǎn)，為此本試驗(yàn)進(jìn)行了殘余CSFV檢測(cè)，結(jié)果顯示免疫熒光和套式RT-PCR檢測(cè)均為陰性。經(jīng)初步分析，以下幾點(diǎn)因素可能有助于減少血清殘余CSFV：選擇健康狀況良好的實(shí)驗(yàn)豬，基礎(chǔ)免疫劑量充足并且在抗體陽(yáng)轉(zhuǎn)后開(kāi)始攻毒；我國(guó)馴化發(fā)明的豬瘟兔化弱毒疫苗本身非常優(yōu)異，該疫苗免疫不僅能誘導(dǎo)完全的臨床保護(hù)(不發(fā)病)，而且能產(chǎn)生完全的“病毒學(xué)”保護(hù)(不出現(xiàn)病毒血癥，不排毒)[7]；采血時(shí)機(jī)的把握，一般在監(jiān)測(cè)到抗體峰值后一周內(nèi)采血為宜。即便如此，仍不能完全排除血清殘余CSFV的可能性，因此仍有必要進(jìn)行嚴(yán)格的CSFV檢測(cè)，一旦CSFV檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性，則應(yīng)該用鈷60射線照射處理，但會(huì)顯著降低抗體效價(jià)。

另外，由于易受動(dòng)物個(gè)體差異、環(huán)境和人為操作等影響，在生產(chǎn)實(shí)際中用兔體反應(yīng)測(cè)定豬瘟兔化弱毒含量可能存在較大誤差，因此在使用該血清進(jìn)行檢驗(yàn)時(shí)可以參照標(biāo)定的中和效價(jià)，根據(jù)實(shí)際情況適當(dāng)降低血清稀釋度進(jìn)行中和試驗(yàn)，確保血清能將兔化弱毒完全中和。

[1]農(nóng)業(yè)部第四屆獸用生物制品規(guī)程委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸用生物制品規(guī)程[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2000.

[2]中國(guó)獸藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)獸藥典[M].2005年版3部，北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2006.

[3]全浩.標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)及其應(yīng)用技術(shù)[M].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

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[6]戴志紅，趙耘，寧宜寶，等.豬瘟病毒FJFQ-39株的毒力鑒定[J].中國(guó)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，30(9)：694-698.

[7]仇華吉，童光志，沈榮顯.豬瘟兔化弱毒疫苗-半個(gè)世紀(jì)的回顧[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2005，38(8)：1675-1685.