植物PPDK基因在基因工程中的應(yīng)用

王原媛，白云鳳，張定宇

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)研究生學(xué)院，山西太谷030801；2.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物遺傳研究所，山西太原030031；3.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

1 PPDK基因的結(jié)構(gòu)及其功能

在植物的C4代謝途徑和景天酸代謝途徑（Crassulacean acid metabolism，CAM）中存在一種叫作丙酮酸磷酸雙激酶（Pyruvateorthophosphate dikinase，PPDK）的限速酶。PPDK基因大部分位于植物的葉肉細(xì)胞中催化丙酮酸（Pyruvate）生成磷酸烯醇式丙酮酸（Phosphoenolpyruvate，PEP）。在細(xì)菌、原生動物等生物體中也均發(fā)現(xiàn)有PPDK酶存在，在這些生物體中PPDK起丙酮酸激酶的作用，催化丙酮酸和ATP生成的反應(yīng)。原生動物、細(xì)菌與植物的一級結(jié)構(gòu)十分相似，這種一級結(jié)構(gòu)上的高度同源性說明在原核生物及真核生物分化之前，原始的PPDK基因就已經(jīng)出現(xiàn)了（表 1）。

表1 原生動物、細(xì)菌與植物中PPDK基因的區(qū)別

在植物體內(nèi)，丙酮酸磷酸二激酶首先以一個 大的前體蛋白形式在細(xì)胞質(zhì)中被合成，并在葉綠體中加工為成熟的酶。PPDK基因的cDNA序列最先是由Matsuoka等人從玉米中克隆出來的，然后根據(jù)cDNA序列預(yù)測其氨基酸序列，這也是完整的PPDK蛋白一級結(jié)構(gòu)的最早研究。玉米cDNA序列中包含有一個長2 844 bp的開放讀碼框，其分子量是編碼為947個氨基酸的多肽。

Matsuoka等人通過確定純化酶的N端氨基酸序列，結(jié)果表明，成熟的酶含有876個氨基酸殘基，轉(zhuǎn)運肽含有71個氨基酸殘基，從而確定了轉(zhuǎn)運肽的剪切。將PPDK酶的轉(zhuǎn)運肽與其他核基因編碼的葉綠體蛋白進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，PPDK轉(zhuǎn)運肽與1，5－二磷酸核酮糖酶小亞基及捕光復(fù)合體AB的轉(zhuǎn)運肽有3個區(qū)域較為相似，N端的氨基酸序列MAASV類似N端同源區(qū)MAXSX，中間序列TSFARRSV與小麥同源區(qū)II SSFAGKAV類似，第三段序列SGAGRGQHC與玉米1，5－二磷酸核酮糖小亞基轉(zhuǎn)運肽剪切位點附近序列SNGGRIRC類似。這些序列都位于各自肽鏈的相同位置，不過，PPDK轉(zhuǎn)運肽的長度比其他酶的轉(zhuǎn)運肽要長得多。

2 PPDK基因在C4循環(huán)和C3植物中的研究

2.1 C4循環(huán)中的PPDK基因

在植物體內(nèi)的C4代謝途徑，植物以及PPDK的具體作用是催化一個可逆的三步反應(yīng)，將ATP，Pi和丙酮酸生成磷酸烯醇式丙酮酸。反應(yīng)的第一步是將ATP的γ-磷酸及β-磷酸轉(zhuǎn)移到酶活性位點的組氨酸殘基上，第二步是將γ-磷酸轉(zhuǎn)移至磷酸，第三步將剩余的β-磷酸轉(zhuǎn)移到丙酮酸?？偡磻?yīng)式如下:

丙酮酸＋腺嘌呤 -P-Pβ-Pγ+Pi→PEPβ+AMP+PPiγ+2H+

從PPDK蛋白的晶體結(jié)構(gòu)中可以看出，其催化反應(yīng)可能是在一個蛋白結(jié)構(gòu)域中（包含通過核苷酸及丙酮酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域間的鉸鏈區(qū)盤曲折疊而成的活性位點）進(jìn)行的。

C4循環(huán)途徑較C3途徑具有更大的優(yōu)勢，其能在外界CO2濃度較低的情況下，通過它的酶系統(tǒng)（磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPCase）、NADP-蘋果酸脫氫酶（NADP-MDH）、NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）和丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）等[2]）保持高效的CO2同化率。其中，PPDK是C4植物光合反應(yīng)中的一個葉綠體酶，同時是C4途徑的專一性酶，該酶催化CO2初級受體——磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的生成。該催化反應(yīng)主要受到光的調(diào)控，是C4光合作用途徑的限速步驟之一。在C4植物的葉片中，丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）主要位于葉綠體的葉肉細(xì)胞氣孔中，C4植物在高光強(qiáng)和高溫的條件下，比C3植物具有更強(qiáng)的光合效率，在C4途徑中，由于CO2在維管束鞘細(xì)胞中濃縮，氧化（oxylase）受到抑制或者停止，以至于光呼吸可以忽略。

2.2 PPDK基因在C4途徑的酶分子生物學(xué)中的研究

隨著C3植物中C4途徑存在的證實及分子生物學(xué)手段的運用，人們更深刻地了解C4途徑酶類的分子機(jī)理及它們在C3植物體內(nèi)的表達(dá)。Agarie等認(rèn)為，PPDK在一種兩棲類植物荸薺（Eleocharis）體內(nèi)表達(dá)的研究是近年來研究最為成功的例子。在陸生環(huán)境下，荸薺進(jìn)行C4循環(huán)途徑，但在水生環(huán)境下，荸薺進(jìn)行C3方式的循環(huán)途徑。通過研究丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的同源（分別為陸生和水生環(huán)境下）基因PPDK 1和PPDK2，證明了盡管基因PPDK1和PPDK2同源性很高，但卻不完全相同。PPDK1和PPDK2分別編碼一個葉綠體PPDK和一個細(xì)胞質(zhì)PPDK。原因在于PPDK1蛋白是由cDNA的核序列編碼，且包含一個特殊的N端區(qū)域，可能作為葉綠體的轉(zhuǎn)移肽，然而PPDK2缺乏這個特殊區(qū)域。核DNA編碼的PPDK基因，其細(xì)胞專一性表達(dá)是在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控的，PPDK1和PPDK2從2個不同的起始點轉(zhuǎn)錄。在2個不同的起動子的控制下，大的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是葉綠體PPDK，包括轉(zhuǎn)運肽；小的產(chǎn)物是細(xì)胞質(zhì)PPDK?；蚪M的Southern印跡結(jié)果表明，在荸薺的基因組中存在小的PPDK基因家族?；蚪M的Northern印跡結(jié)果表明，荸薺的葉綠體PPDK1和細(xì)胞質(zhì)PPDK2都是在其空心稈（荸薺的光合器官）中表達(dá)，但是這些基因的表達(dá)隨著荸薺處于生態(tài)環(huán)境條件的不同而不同。當(dāng)荸薺在陸生環(huán)境中時，其空心稈具有Kranz結(jié)構(gòu)并以C4循環(huán)途徑進(jìn)行光合作用；當(dāng)荸薺在水生環(huán)境中時，其空心稈以C3循環(huán)途徑進(jìn)行光合作用。

2.3 C3植物中的PPDK基因

C3植物中是否存在C4光合途徑一直受到很多科研人員的關(guān)注，在C4植物葉片中有特殊的Kranz結(jié)構(gòu)。有研究顯示，C4植物是從C3植物中分化出來的，而且這種轉(zhuǎn)變在進(jìn)化上是多源的。Sheen認(rèn)為，C4型PPDK基因在C3植物中可能有一個祖先，含有一個類似于C4型基因的結(jié)構(gòu)，通過引入第一外顯子——一個編碼非常重要的轉(zhuǎn)入葉綠體的轉(zhuǎn)運肽而成為C4基因。但是目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在水稻等C3植物中的PPDK基因與C4型的PPDK基因一樣，也具有2個不同的啟動子轉(zhuǎn)錄的不同起始位點。在水生植物Hydrilla verticilata[3]和 Egeria densa[4]中沒有 Kranz 結(jié)構(gòu)，但是卻存在C4光合途徑的運行，說明在植物葉片的單一光合細(xì)胞中可以進(jìn)行C4光合微循環(huán)。早有報道，在 C3作物大豆[5]、小麥[6]、水稻[7]葉片中有 C4光合酶系統(tǒng)，由于酶活性較低，因此提出C3植物葉片中可能具有有限的C4光合途徑。Chen等[8]研究指出，向C3植物菠菜中外加C4光合原初產(chǎn)物OAA或MA，可提高葉片的光合能力，這為在C3植物中建立C4微循環(huán)系統(tǒng)以提高光合效率的可能性提供了依據(jù)[9]。

Aoyagi等證實，在C3植物中存在著與C4植物同樣的丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）。已有報道，C3植物中的PPDK與C4植物中的PPDK具有相同的酶學(xué)特征，如被光激活、對冷脅迫的敏感，催化性質(zhì)等。Hata以及Aoyagi等證明，PPDK不但存在于葉綠體中，而且還存在于小麥種子的細(xì)胞質(zhì)中，Imaizumi通過Northern blot分析發(fā)現(xiàn)，在水稻種子的細(xì)胞質(zhì)中有PPDK的存在。PPDK大部分位于葉肉細(xì)胞，它的活性已在C3植物的光合組織中被測定。Hata等發(fā)現(xiàn)，C3植物水稻幼苗體內(nèi)的PPDK與C4植物玉米的PPDK無論在蛋白分子量，還是抗原決定簇和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)等方面都相同。

3 PPDK基因在植物基因工程領(lǐng)域的應(yīng)用

3.1 轉(zhuǎn)基因煙草植株中PPDK基因與鋁脅迫的關(guān)系

將C3植物冰葉日中花（M crystallinum）的PPDK基因轉(zhuǎn)入煙草的基因組中，轉(zhuǎn)基因的煙草就能通過根部有機(jī)酸的分泌來抵抗鋁的脅迫。在高等植物的細(xì)胞質(zhì)和葉綠體中，PPDK基因的表達(dá)水平受干旱和鹽脅迫的影響。通過在轉(zhuǎn)錄水平對patatin基因家族B33啟動子的調(diào)控，生產(chǎn)出表達(dá)冰葉日中花PPDK或者ΔPPDK的轉(zhuǎn)基因煙草植物并發(fā)現(xiàn)它們可以改善鋁的脅迫。在轉(zhuǎn)基因植株中，當(dāng)受到鋁脅迫時根的生長加強(qiáng)；然而在野生的植株中根的生長卻被強(qiáng)烈地抑制。通過ECR染色和原子吸收光譜測定，在轉(zhuǎn)基因植株根尖鋁的含量要比野生植株含量低。此外，轉(zhuǎn)基因植株所產(chǎn)生的三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物（檸檬酸和蘋果酸）要比野生植株高。通過對ECR根染色、有機(jī)酸分泌和鋁積累的研究發(fā)現(xiàn)，2種轉(zhuǎn)基因植物相比，含有PPDK基因的植株比表達(dá)ΔPPDK基因的植株對鋁脅迫有更強(qiáng)的耐受力[10]。

3.2 PPDK轉(zhuǎn)基因水稻的研究進(jìn)展

隨著科學(xué)技術(shù)特別是分子生物學(xué)方面的發(fā)展，目前已成功將磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）、NADP-蘋果酸酶（NADP-ME）轉(zhuǎn)到水稻中獲得了5種轉(zhuǎn)基因水稻。Schreiber等[11]將已導(dǎo)入玉米C4光合關(guān)鍵酶磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶（PEPC）、丙酮酸磷酸 二 激 酶 （PPDK）、NADP- 蘋 果 酸 酶（NADP-ME）和PEPC+PPDK的轉(zhuǎn)基因水稻為材料，以其受體品種Kitaake（WT）為對照，對C4轉(zhuǎn)基因水稻秧苗葉片氣孔與葉鞘維管束的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行研究，結(jié)果表明，品系葉片上的氣孔密度最高，其氣孔總面積（是對照的1.47倍）在轉(zhuǎn)基因品系中也是最高，轉(zhuǎn)基因PPDK品系水稻秧苗干質(zhì)量明顯高于對照品種，其葉片的類囊體結(jié)構(gòu)也比對照品種更完整、有序，有利于光能轉(zhuǎn)換，但是其葉鞘維管束組織卻不如對照發(fā)達(dá)。綜合以上結(jié)論，PPDK仍然具有轉(zhuǎn)基因水稻高光效表達(dá)的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。季本華等[9]利用亞硫酸氫鈉對轉(zhuǎn)PEPC基因水稻葉片進(jìn)行噴施，發(fā)現(xiàn)其凈光合速率的增加幅度較大。

3.3 PPDK轉(zhuǎn)基因秈稻IR64的研究進(jìn)展

在具有增加20倍光合作用酶活性的轉(zhuǎn)基因水稻中，C4基因?qū)3植物水稻的生理沖擊是很小的，沒有觀察到水稻光合作用特征的改變。張建福等研究的玉米高光效基因PPDK在秈稻IR64中的整合及其與光合作用相關(guān)的特性分析表明，丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的反應(yīng)是逆向的，依賴于底物、活化劑和非活化劑的濃度。這可能是丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的過量表達(dá)不能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因水稻葉片碳代謝顯著效應(yīng)的原因。盡管是初步的結(jié)論，但丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）的過量表達(dá)可以增加每叢轉(zhuǎn)基因水稻植株的粒數(shù)和千粒質(zhì)量。對轉(zhuǎn)基因IR64植株的分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因IR64植株劍葉的全氮含量比非轉(zhuǎn)基因IR64植株高，說明玉米丙酮酸磷酸雙激酶（PPDK）基因能夠促進(jìn)轉(zhuǎn)基因IR64植株對土壤中氮的吸收和同化，而且在溫室條件下，大部分轉(zhuǎn)基因IR64植株的結(jié)實率和收獲指數(shù)高于非轉(zhuǎn)基因植株[12]。

3.4 大豆中PPDK基因的研究進(jìn)展

Li等[5]研究大豆葉片C4循環(huán)途徑酶表明，不同發(fā)育時期大豆葉片內(nèi)均存在PPDK酶作為C4途徑的再生磷酸烯醇式丙酮酸的特定酶PPDK，其變化趨勢是從苗期到初莢期酶活性逐漸升高，然后降低。在初莢期，PPDK酶活性均達(dá)到最高值。

4 展望

目前，已經(jīng)明確了植物PPDK基因是C4植物的限速酶之一，對植物光合效率的提高有至關(guān)重要的作用，而且已經(jīng)成功運用植物基因工程將C4植物的PPDK基因?qū)隒3植物中，但PPDK基因的許多優(yōu)勢作用目前尚未明確，所以，運用包括分子生物學(xué)在內(nèi)的各種方法，研究PPDK對光合作用、植物抗性等的具體影響方式，并將其優(yōu)勢功能運用于其他農(nóng)作物，將會成為今后一個重要的研究方向。

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